L'assorbimento e l'ulteriore riemissione della luce da parte di mezzi inorganici e organici è il risultato della fosforescenza o della fluorescenza. La differenza tra i fenomeni è la lunghezza dell'intervallo tra l'assorbimento della luce e l'emissione del flusso. Con la fluorescenza, questi processi si verificano quasi simultaneamente, e con la fosforescenza, con un certo ritardo.
Sfondo storico
Nel 1852, lo scienziato britannico Stokes descrisse per la prima volta la fluorescenza. Ha coniato il nuovo termine come risultato dei suoi esperimenti con la fluorite, che emetteva luce rossa quando esposta alla luce ultravioletta. Stokes ha notato un fenomeno interessante. Ha scoperto che la lunghezza d'onda della luce fluorescente è sempre più lunga di quella della luce di eccitazione.
Nel 19° secolo furono effettuati molti esperimenti per confermare l'ipotesi. Hanno dimostrato che una varietà di campioni emette fluorescenza se esposti alla luce ultravioletta. I materiali includevano, tra gli altri, cristalli, resine, minerali, clorofilla,materie prime medicinali, composti inorganici, vitamine, oli. L'uso diretto dei coloranti per l'analisi biologica iniziò solo nel 1930
Descrizione della microscopia a fluorescenza
Alcuni dei materiali utilizzati nella ricerca nella prima metà del 20° secolo erano altamente specifici. Grazie a indicatori che non potevano essere raggiunti con metodi di contrasto, il metodo della microscopia a fluorescenza è diventato uno strumento importante nella ricerca sia biomedica che biologica. I risultati ottenuti sono stati di non poca importanza per la scienza dei materiali.
Quali sono i vantaggi della microscopia a fluorescenza? Con l'aiuto di nuovi materiali, è diventato possibile isolare cellule altamente specifiche e componenti submicroscopici. Un microscopio a fluorescenza consente di rilevare singole molecole. Una varietà di coloranti consente di identificare più elementi contemporaneamente. Sebbene la risoluzione spaziale dell'apparecchiatura sia limitata dal limite di diffrazione, che, a sua volta, dipende dalle proprietà specifiche del campione, anche la rilevazione di molecole al di sotto di questo livello è del tutto possibile. Vari campioni mostrano autofluorescenza dopo l'irradiazione. Questo fenomeno è ampiamente utilizzato nell'industria petrolifera, botanica e dei semiconduttori.
Caratteristiche
Lo studio dei tessuti animali o dei microrganismi patogeni è spesso complicato da un'autofluorescenza non specifica troppo debole o molto forte. Tuttavia, il valore inla ricerca acquisisce l'introduzione nel materiale di componenti eccitati ad una determinata lunghezza d'onda e che emettono un flusso luminoso dell'intensità richiesta. I fluorocromi agiscono come coloranti capaci di autoattaccarsi alle strutture (invisibili o visibili). Allo stesso tempo, si distinguono per l'elevata selettività rispetto ai target e la resa quantistica.
La microscopia a fluorescenza è diventata ampiamente utilizzata con l'avvento dei coloranti naturali e sintetici. Avevano profili di intensità di emissione e di eccitazione specifici ed erano mirati a specifici bersagli biologici.
Identificazione delle singole molecole
Spesso, in condizioni ideali, puoi registrare il bagliore di un singolo elemento. Per fare ciò, tra l' altro, è necessario garantire un rumore del rivelatore e un sottofondo ottico sufficientemente bassi. Una molecola di fluoresceina può emettere fino a 300.000 fotoni prima della distruzione dovuta al fotosbiancamento. Con un tasso di raccolta del 20% e un'efficienza del processo, possono essere registrati per un importo di circa 60 mila
La microscopia a fluorescenza, basata sui fotodiodi a valanga o sulla moltiplicazione elettronica, ha permesso ai ricercatori di osservare il comportamento delle singole molecole per secondi, e in alcuni casi minuti.
Difficoltà
Il problema principale è la soppressione del rumore di fondo ottico. A causa del fatto che molti dei materiali utilizzati nella costruzione di filtri e lenti mostrano una certa autofluorescenza, gli sforzi degli scienziati nelle fasi iniziali si sono concentrati sull'emissionecomponenti a bassa fluorescenza. Tuttavia, gli esperimenti successivi hanno portato a nuove conclusioni. In particolare, è stato riscontrato che la microscopia a fluorescenza basata sulla riflessione interna totale consente di ottenere uno sfondo basso e un'emissione di luce ad alta eccitazione.
Meccanismo
I principi della microscopia a fluorescenza basati sulla riflessione interna totale consistono nell'usare un'onda in rapido decadimento o non propagante. Sorge all'interfaccia tra mezzi con diversi indici di rifrazione. In questo caso, il raggio di luce passa attraverso un prisma. Ha un alto indice di rifrazione.
Il prisma è adiacente a una soluzione acquosa oa un vetro a basso parametro. Se il raggio di luce è diretto verso di esso con un angolo maggiore di quello critico, il raggio viene riflesso completamente dall'interfaccia. Questo fenomeno, a sua volta, dà origine a un'onda non propagante. In altre parole, si genera un campo elettromagnetico che penetra in un mezzo con un indice di rifrazione inferiore a una distanza inferiore a 200 nanometri.
In un'onda non propagante, l'intensità della luce sarà abbastanza sufficiente per eccitare i fluorofori. Tuttavia, a causa della sua profondità eccezionalmente ridotta, il suo volume sarà molto piccolo. Il risultato è uno sfondo di basso livello.
Modifica
La microscopia a fluorescenza basata sulla riflessione interna totale può essere realizzata con epiilluminazione. Ciò richiede obiettivi con apertura numerica aumentata (almeno 1,4, ma è auspicabile che raggiunga 1,45-1,6), nonché un campo parzialmente illuminato dell'apparato. Quest'ultimo si ottiene con un piccolo spot. Per una maggiore uniformità viene utilizzato un anello sottile, attraverso il quale viene bloccata parte del flusso. Per ottenere un angolo critico dopo il quale si verifica la riflessione totale, è necessario un elevato livello di rifrazione del mezzo di immersione nelle lenti e nel vetro di copertura del microscopio.
