Quando si studiano le sostanze in chimica organica, vengono utilizzate più di una dozzina di diverse reazioni qualitative per determinare il contenuto di determinati composti. Tale analisi visiva consente di capire immediatamente se sono presenti le sostanze necessarie e, se non sono presenti, è possibile ridurre significativamente ulteriori esperimenti per identificarle. Queste reazioni includono la ninidrina, che è la principale nella determinazione visiva dei composti amminici.
Cos'è questo?
Ninhydrin è un composto dicarbonile contenente un anello aromatico con un eterociclo attaccato, il secondo atomo del quale ha 2 gruppi ossidrile (OH-). Questa sostanza si ottiene per ossidazione diretta dell'inandione - 1, 3, e, quindi, secondo la nomenclatura internazionale, ha il seguente nome: 2, 2 - diidrossiinandione -1, 3 (Fig. 1).
La ninidrina pura è un cristallo giallo o biancocolori che, una volta riscaldati, si dissolvono bene in acqua e altri solventi organici polari, come l'acetone. Questa è una sostanza piuttosto dannosa, se viene a contatto con la pelle in grandi quantità o con le mucose, provoca irritazione, anche se inalata. Lavorare con questo composto dovrebbe essere attento e solo con i guanti, poiché quando viene a contatto con la pelle, reagisce con le proteine delle cellule della pelle e la macchia di viola.
Sostanze reattive
Come accennato in precedenza, la reazione ninidrina viene utilizzata principalmente per la determinazione visiva del contenuto di composti amminici:
- α-aminoacidi (compresi nelle proteine);
- zuccheri amminici;
- alcaloidi contenenti gruppi –NH2 e -NH;
- varie ammine.
Va notato che le ammine secondarie e terziarie a volte reagiscono molto debolmente, quindi sono necessarie ulteriori ricerche per confermare la loro presenza.
Per la determinazione quantitativa vengono utilizzati vari metodi di cromatografia, ad esempio cromatografia su carta (BC), cromatografia su strato sottile (TLC) o con lavaggio di veicoli solidi con una soluzione di ninidrina in vari mezzi.
Questa reazione non è specifica per i composti amminici, poiché il reagente può entrarvi tutto in una volta. Tuttavia, da parte dei prodotti di reazione, ha una particolarità sotto forma di rilascio di bolle di anidride carbonica (CO2), e questo è tipico solo quando si interagisce con α-amino acidi.
Caratteristiche del meccanismo
BCi sono diverse interpretazioni dell'equazione di reazione della ninidrina in letteratura. Alcuni ricercatori omettono la formazione di idrindantina dal 2-aminoinandione, che, con la partecipazione di ammoniaca e ninidrina, forma anche una sostanza colorante chiamata "porpora di Rueman" (o "blu di Rueman"), mentre altri, al contrario, ne assumono solo la partecipazione senza la presenza di prodotti amminici intermedi. Ci sono anche alcuni punti interessanti nella registrazione della reazione stessa, in particolare, questo riguarda i metodi per attaccare l'ammino derivato della ninidrina alla sua molecola principale per formare un colorante. Rimane discutibile anche l'indicazione della posizione dell'“idrogeno ambulante” ottenuto dall'ammina intermedia dal mezzo acquoso: può essere nel gruppo chetonico o vicino a –NH2.
In re altà, la sfumatura con l'atomo H è insignificante, poiché la sua posizione nel composto non gioca un ruolo speciale nel corso della reazione, quindi non dovrebbe essere prestata attenzione. Per quanto riguarda l'omissione di uno dei possibili stadi, la ragione sta nell'aspetto teorico: fino ad ora, l'esatto meccanismo per la formazione della porpora di Rueman non è stato determinato con precisione, quindi si possono trovare schemi abbastanza diversi della reazione della ninidrina.
Il corso più completo possibile di interazione del reagente con i composti amminici sarà proposto di seguito.
Meccanismo di reazione
In primo luogo, la ninidrina interagisce con l'α-amminoacido, legandolo al sito di scissione dei gruppi idrossilici e formando un prodotto di condensazione (Fig. 2a). Quindi quest'ultimo viene distrutto, rilasciando l'ammina intermedia, l'aldeide e l'anidride carbonica (Fig. 2b). Dal prodotto finale al momento dell'adesioneviene sintetizzata la ninidrina, la struttura viola di Rueman (diketonhydrindenketohydrinamine, Fig. 2c). Indicata anche la possibile formazione di idrindantina (ninidrina ridotta) dall'ammina intermedia, che si trasforma anche in un composto colorante in presenza di ammoniaca (più precisamente, idrossido di ammonio) con un eccesso del reagente stesso (Fig. 2d).
La formazione dell'idrindantino è stata provata dallo stesso Rueman quando l'idrogeno solforato agisce sulla molecola della ninidrina. Questo composto è in grado di dissolversi in carbonato di sodio Na2CO3, colorando la soluzione di rosso scuro. E quando si aggiunge acido cloridrico diluito, l'idrindantina precipita.
Molto probabilmente, l'ammina intermedia, l'idridantina, la ninidrina e la struttura del colorante, a causa della loro instabilità quando riscaldata, sono in un certo equilibrio, che consente la presenza di diversi stadi aggiuntivi.
Questo meccanismo è adatto per spiegare la reazione della ninidrina con altri composti amminici, ad eccezione dei sottoprodotti risultanti dall'eliminazione del resto della struttura da –NH2, -NH o -N.
Test del biureto e altre reazioni alle proteine
L'analisi qualitativa per i legami peptidici anche di strutture non proteiche può avvenire non solo con la partecipazione del suddetto reagente. Tuttavia, nel caso di una reazione della ninidrina alle proteine, l'interazione non avviene lungo i gruppi –CO-NH‒, ma lungo i gruppi amminici. Esiste una cosiddetta "reazione del biureto", che è caratterizzata dall'aggiunta di ioni alla soluzione con composti amminicirame bivalente da CuSO4 o Cu(OH)2 in un mezzo alcalino (Fig. 3).
Durante l'analisi, in presenza delle strutture necessarie, la soluzione si colora di blu scuro per il legame dei legami peptidici in un complesso di colore, che distingue un reagente dall' altro. Ecco perché le reazioni del biureto e della ninidrina sono universali in relazione alle strutture proteiche e non proteiche del gruppo –CO-NH‒.
Quando si determinano gli amminoacidi ciclici, viene utilizzata una reazione xantoproteica con una soluzione concentrata di acido nitrico HNO3 , che dà un colore giallo quando nitrato. Una goccia di reagente sulla pelle mostra anche un colore giallo reagendo con gli aminoacidi nelle cellule della pelle. L'acido nitrico può causare ustioni e dovrebbe anche essere maneggiato con i guanti.
Esempi di interazione con composti amminici
La reazione di ninidrina per gli α-amminoacidi dà un buon risultato visivo, fatta eccezione per le strutture di colore prolina e idrossiprolina, che reagiscono con la formazione di un colore giallo. Una possibile spiegazione di questo effetto è stata trovata in altre condizioni ambientali dell'interazione della ninidrina con queste strutture.
Reazione con il gruppo amminico
Poiché il test non è specifico, non è possibile rilevare visivamente l'alanina utilizzando la reazione alla ninidrina nella miscela. Tuttavia, mediante cromatografia su carta, quando si applicano campioni di vari α-amminoacidi, spruzzandoli con una soluzione acquosa di ninidrina e sviluppando in un mezzo speciale, è possibilecalcola la composizione quantitativa non solo del composto dichiarato, ma anche di molti altri.
Schematicamente, l'interazione dell'alanina con la ninidrina segue lo stesso principio. Si attacca al reagente nel gruppo amminico e sotto l'azione degli ioni idronio attivi (H3O+) viene scisso al carbonio -legame azoto, che si decompone in acetaldeide (CH3COH) e anidride carbonica (CO2). Un' altra molecola di ninidrina si attacca all'azoto, spostando le molecole d'acqua e si forma una struttura colorante (Fig. 4).
Reazione con un composto amminico eterociclico
La reazione della ninidrina con la prolina è specifica, soprattutto nelle analisi cromatografiche, poiché tali strutture in un mezzo acido ingialliscono prima, e poi diventano viola in uno neutro. I ricercatori lo spiegano con una caratteristica del riarrangiamento del ciclo nel composto intermedio, che è influenzato proprio dalla presenza di un gran numero di protoni idrogeno che completano il livello energetico esterno dell'azoto.
La distruzione dell'eterociclo non avviene e un' altra molecola di ninidrina è attaccata ad esso al 4° atomo di carbonio. Dopo un ulteriore riscaldamento, la struttura risultante in un mezzo neutro diventa viola Rueman (Fig. 5).
Preparazione del reagente principale
Il test della ninidrina viene eseguito con diverse soluzioni, a seconda della dissoluzione delle strutture amminiche in alcune sostanze organiche ecomposti inorganici.
Il principale reagente è la preparazione di una soluzione allo 0,2% in acqua. Questa è una miscela versatile, poiché la maggior parte dei composti si dissolve bene in H2O. Per ottenere un reagente appena preparato, un campione di 0,2 g di ninidrina chimicamente pura viene diluito in 100 ml di acqua.
Vale la pena notare che per alcune soluzioni analizzate questa concentrazione è insufficiente, quindi è possibile preparare soluzioni all'1% o al 2%. Questo è tipico degli estratti di materie prime medicinali, poiché contengono varie classi di composti amminici.
Quando si eseguono studi cromatografici, le soluzioni, ad esempio, quando si lava una miscela su un supporto solido attraverso una colonna, possono essere preparate in alcol, dimetilsolfossido, acetone e altri solventi polari: tutto dipenderà dal solvente di alcuni strutture amminiche.
Applicazione
La reazione della ninidrina permette di rilevare molti composti amminici in soluzione, il che lo ha reso uno dei primi ad essere utilizzato nell'analisi qualitativa delle sostanze organiche. La determinazione visiva riduce significativamente il numero di esperimenti, soprattutto quando si analizzano piante, farmaci e forme di dosaggio poco studiati, nonché soluzioni e miscele sconosciute.
Nella scienza forense, questo metodo è ampiamente utilizzato per determinare la presenza di segni di sudore su qualsiasi superficie.
Anche nonostante la non specificità della reazione, il ritiro della reazione alla ninidrina dalla pratica chimica è impossibile, poichéla sostituzione di questa sostanza con analoghi meno tossici (ad esempio l'ossolina) ha dimostrato che hanno una minore sensibilità ai gruppi amminici e non danno buoni risultati nelle analisi fotometriche.
