I metodi di ricerca biologica molecolare svolgono un ruolo importante nella medicina moderna, nella medicina legale e nella biologia. Grazie ai progressi nello studio del DNA e dell'RNA, una persona è in grado di studiare il genoma di un organismo, determinare l'agente eziologico di una malattia, riconoscere l'acido nucleico desiderato in una miscela di acidi, ecc.
Metodi di ricerca biologica molecolare. Che cos'è?
Negli anni '70 e '80, gli scienziati per la prima volta riuscirono a decifrare il genoma umano. Questo evento ha dato impulso allo sviluppo dell'ingegneria genetica e della biologia molecolare. Lo studio delle proprietà del DNA e dell'RNA ha portato al fatto che ora è possibile utilizzare questi acidi nucleici per diagnosticare una malattia, studiare i geni.
Ottenere DNA e RNA
I metodi diagnostici biologici molecolari richiedono la presenza di materiale di partenza: più spesso si tratta di acidi nucleici. Esistono diversi modi per isolare queste sostanze dalle cellule degli organismi viventi. Ognuno di loro ha i suoi vantaggi e svantaggi, ed è necessariotenere in considerazione quando si sceglie un metodo per isolare gli acidi nucleici puri.
1. Ottenere il DNA secondo Marmur. Il metodo consiste nel trattare una miscela di sostanze con alcol, a seguito della quale precipita il DNA puro. Lo svantaggio di questo metodo è l'uso di sostanze aggressive: fenolo e cloroformio.
2. Isolamento del DNA secondo Boom. La sostanza principale utilizzata qui è il tiocianato di guanidina (GuSCN). Contribuisce alla precipitazione dell'acido desossiribonucleico su substrati specializzati, dai quali può essere successivamente raccolto mediante uno speciale tampone. Tuttavia, GuSCN è un inibitore del PTC e anche una piccola parte di esso che penetra nel DNA precipitato può influenzare il corso della reazione a catena della polimerasi, che svolge un ruolo importante nel lavoro con gli acidi nucleici.
3. Sedimentazione delle impurità. Il metodo differisce dai precedenti in quanto non sono le molecole di acido desossiribonucleico a precipitare, ma le impurità. Per fare ciò, vengono utilizzati scambiatori di ioni. Lo svantaggio è che non tutte le sostanze possono precipitare.
4. Proiezione di massa. Questo metodo viene utilizzato nei casi in cui non sono necessarie informazioni esatte sulla composizione della molecola di DNA, ma è necessario ottenere alcuni dati statistici. Ciò è spiegato dal fatto che la struttura dell'acido nucleico può essere danneggiata se trattata con detergenti, in particolare alcali.
Classificazione dei metodi di ricerca
Tutti i metodi di ricerca biologica molecolare sono divisi in tre grandi gruppi:
1. Amplificazione (usando molti enzimi). Quisi riferisce alla PCR - reazione a catena della polimerasi, che svolge un ruolo importante in molti dei metodi diagnostici.
2. Non amplificante. Questo gruppo di metodi è direttamente correlato al funzionamento di miscele di acidi nucleici. Esempi sono 3 blot, ibridazione in situ, ecc.
3. Metodi basati sul riconoscimento di un segnale proveniente da una molecola sonda che si lega a uno specifico DNA o RNA sonda. Un esempio è l'Hybride Capture System (hc2).
Enzimi che possono essere utilizzati nei metodi di ricerca di biologia molecolare
Molti metodi diagnostici molecolari implicano l'uso di un'ampia gamma di enzimi. Di seguito sono riportati i più comunemente usati:
1. Enzima di restrizione - "taglia" la molecola di DNA nelle parti necessarie.
2. DNA polimerasi - sintetizza una molecola a doppio filamento di acido desossiribonucleico.
3. Trascrittasi inversa (revertasi) - usata per sintetizzare il DNA su un modello di RNA.
4. DNA ligasi - responsabile della formazione di legami fosfodiestere tra nucleotidi.
5. Esonucleasi - rimuove i nucleotidi dalle sezioni terminali della molecola di acido desossiribonucleico.
La PCR è il metodo principale di amplificazione del DNA
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è attivamente utilizzata nella moderna biologia molecolare. Questo è un metodo in cui è possibile ottenere un numero enorme di copie da una singola molecola di DNA (le molecole vengono amplificate).
Funzioni principali della PCR:
- diagnosticamalattie;
- clonazione di segmenti di DNA, geni.
Per effettuare una reazione a catena della polimerasi sono necessari i seguenti elementi: la molecola di DNA iniziale, una DNA polimerasi termostabile (Taq o Pfu), fosfati desossiribonucleotidici (fonti di basi azotate), primer (2 primer per 1 molecola di DNA) e il sistema tampone stesso, in cui tutte le reazioni sono possibili.
La PCR consiste in tre fasi: denaturazione, ricottura del primer e allungamento.
1. Denaturazione. A una temperatura di 94-95 gradi Celsius, i legami idrogeno tra i due filamenti di DNA si rompono e di conseguenza otteniamo due molecole a filamento singolo.
2. Ricottura del primer. A una temperatura di 50-60 gradi Celsius, i primer sono attaccati alle estremità delle molecole di acido nucleico a filamento singolo in base al tipo di complementarità.
3. Allungamento. A una temperatura di 72 gradi avviene la sintesi delle molecole figlie a doppio filamento di acido desossiribonucleico.
Sequenziamento del DNA
I metodi di ricerca biologica molecolare spesso richiedono la conoscenza della sequenza nucleotidica in una molecola di acido desossiribonucleico. Il sequenziamento viene effettuato per determinare il codice genetico. La diagnostica molecolare del futuro si baserà sulle conoscenze acquisite dal sequenziamento umano.
Si distinguono i seguenti tipi di sequenziamento:
- Sequenziamento Maxam-Gilbert;
- Sequenziamento di Sanger;
- pirosequenziamento;
- nanoporesequenza.
