Il concetto di enzimi immobilizzati è apparso per la prima volta nella seconda metà del 20° secolo. Nel frattempo, nel 1916, si scoprì che il saccarosio assorbito dal carbonio conservava la sua attività catalitica. Nel 1953, D. Schleit e N. Grubhofer effettuarono il primo legame di pepsina, amilasi, carbossipeptidasi e RNasi con un vettore insolubile. Il concetto di enzimi immobilizzati è stato legalizzato nel 1971. Ciò è accaduto alla prima conferenza sull'enzima ingegneria. Attualmente, il concetto di enzimi immobilizzati è considerato in un senso più ampio di quanto non fosse alla fine del XX secolo. Diamo un'occhiata più da vicino a questa categoria.
Informazioni generali
Gli enzimi immobilizzati sono composti che sono legati artificialmente a un vettore insolubile. Tuttavia, mantengono le loro proprietà catalitiche. Attualmente, questo processo è considerato in due aspetti: nel quadro della limitazione parziale e completa della libertà di movimento delle molecole proteiche.
Dignità
Gli scienziati hanno stabilito alcuni vantaggi degli enzimi immobilizzati. Agendo come catalizzatori eterogenei, possono essere facilmente separati dal mezzo di reazione. Nell'ambito della ricerca, è stato riscontrato che l'uso di enzimi immobilizzati può essere ripetuto. Durante il processo di associazione, le connessioni cambiano le proprie proprietà. Acquisiscono specificità e stabilità del substrato. Allo stesso tempo, la loro attività inizia a dipendere dalle condizioni ambientali. Gli enzimi immobilizzati sono durevoli e hanno un alto grado di stabilità. È maggiore, ad esempio, di quella degli enzimi liberi di migliaia, decine di migliaia di volte. Tutto ciò garantisce alta efficienza, competitività ed economia delle tecnologie in cui sono presenti enzimi immobilizzati.
Media
J. Poratu ha identificato le proprietà chiave dei materiali ideali da utilizzare nell'immobilizzazione. I portatori devono avere:
- Insolubilità.
- Elevata resistenza biologica e chimica.
- La possibilità di attivarsi rapidamente. I vettori dovrebbero diventare facilmente reattivi.
- Idrofilia significativa.
- Permeabilità necessaria. Il suo indicatore dovrebbe essere ugualmente accettabile sia per enzimi che per coenzimi, prodotti di reazione e substrati.
Attualmente non esiste materiale che soddisfi pienamente questi requisiti. Tuttavia, in pratica, vengono utilizzati portatori adatti all'immobilizzazione.certa categoria di enzimi in condizioni specifiche.
Classificazione
A seconda della loro natura, i materiali, in relazione ai quali i composti vengono convertiti in enzimi immobilizzati, si dividono in inorganici e organici. Il legame di molti composti viene effettuato con supporti polimerici. Questi materiali organici sono divisi in 2 classi: sintetici e naturali. In ognuno di essi, a loro volta, i gruppi si distinguono a seconda della struttura. I vettori inorganici sono principalmente rappresentati da materiali in vetro, ceramica, argilla, gel di silice e nero di grafite. Quando si lavora con i materiali, i metodi di chimica secca sono popolari. Gli enzimi immobilizzati si ottengono rivestendo i supporti con un film di ossidi di titanio, alluminio, zirconio, afnio o mediante lavorazione con polimeri organici. Un importante vantaggio dei materiali è la facilità di rigenerazione.
Veicoli proteici
I più popolari sono i materiali lipidici, polisaccaridi e proteici. Tra questi ultimi, vale la pena evidenziare i polimeri strutturali. Questi includono principalmente collagene, fibrina, cheratina e gelatina. Tali proteine sono ampiamente distribuite nell'ambiente naturale. Sono convenienti ed economici. Inoltre, hanno un gran numero di gruppi funzionali per il legame. Le proteine sono biodegradabili. Ciò consente di espandere l'uso di enzimi immobilizzati in medicina. Nel frattempo, le proteine hanno anche proprietà negative. Gli svantaggi dell'utilizzo di enzimi immobilizzati su vettori proteici sono l'elevata immunogenicità di quest'ultimo, oltre ala capacità di introdurre solo alcuni gruppi di loro nelle reazioni.
Polisaccaridi, aminosaccaridi
Di questi materiali vengono usati più spesso chitina, destrano, cellulosa, agarosio e loro derivati. Per rendere i polisaccaridi più resistenti alle reazioni, le loro catene lineari sono reticolate con l'epicloridrina. Vari gruppi ionogenici sono introdotti liberamente nelle strutture della rete. La chitina si accumula in grandi quantità come rifiuto durante la lavorazione industriale di gamberetti e granchi. Questa sostanza è resistente agli agenti chimici e ha una struttura porosa ben definita.
Polimeri sintetici
Questo gruppo di materiali è molto vario e accessibile. Comprende polimeri a base di acido acrilico, stirene, alcol polivinilico, polimeri poliuretanici e poliammidici. La maggior parte di loro sono meccanicamente forti. Nel processo di trasformazione, offrono la possibilità di variare la dimensione dei pori entro un intervallo abbastanza ampio, introducendo vari gruppi funzionali.
Metodi di rilegatura
Attualmente, ci sono due opzioni fondamentalmente diverse per l'immobilizzazione. Il primo è ottenere composti senza legami covalenti con il vettore. Questo metodo è fisico. Un' altra opzione prevede l'emergere di un legame covalente con il materiale. Questo è un metodo chimico.
Adsorbimento
Con il suo aiuto, si ottengono enzimi immobilizzati trattenendo il farmaco sulla superficie del vettore a causa didispersione, interazioni idrofobiche, elettrostatiche e legami idrogeno. L'adsorbimento è stato il primo modo per limitare la mobilità degli elementi. Tuttavia, anche ora questa opzione non ha perso la sua rilevanza. Inoltre, l'adsorbimento è considerato il metodo di immobilizzazione più comune nel settore.
Caratteristiche del metodo
Le pubblicazioni scientifiche descrivono più di 70 enzimi ottenuti con il metodo di adsorbimento. I veicoli erano principalmente vetro poroso, argille varie, polisaccaridi, ossidi di alluminio, polimeri sintetici, titanio e altri metalli. Questi ultimi sono i più usati. L'efficacia dell'adsorbimento del farmaco sul supporto è determinata dalla porosità del materiale e dall'area superficiale specifica.
Meccanismo d'azione
L'adsorbimento di enzimi su materiali insolubili è semplice. Si ottiene per contatto di una soluzione acquosa del farmaco con il vettore. Può passare in modo statico o dinamico. La soluzione enzimatica viene miscelata con sedimento fresco, ad esempio idrossido di titanio. Il composto viene quindi essiccato in condizioni blande. L'attività enzimatica durante tale immobilizzazione viene mantenuta di quasi il 100%. Allo stesso tempo, la concentrazione specifica raggiunge 64 mg per grammo di carrier.
Momenti negativi
Gli svantaggi dell'adsorbimento includono una bassa forza quando si lega l'enzima e il vettore. Nel processo di modifica delle condizioni di reazione, si possono notare la perdita di elementi, la contaminazione dei prodotti e il desorbimento delle proteine. Per migliorare la forzai vettori vincolanti sono pre-modificati. In particolare, i materiali sono trattati con ioni metallici, polimeri, composti idrofobici e altri agenti polifunzionali. In alcuni casi, il farmaco stesso viene modificato. Ma molto spesso questo porta a una diminuzione della sua attività.
Inclusione nel gel
Questa opzione è abbastanza comune per la sua unicità e semplicità. Questo metodo è adatto non solo per singoli elementi, ma anche per complessi multienzimatici. L'incorporazione nel gel può essere effettuata in due modi. Nel primo caso, il farmaco viene combinato con una soluzione acquosa del monomero, dopo di che viene eseguita la polimerizzazione. Di conseguenza, appare una struttura di gel spaziale, contenente molecole di enzimi nelle cellule. Nel secondo caso, il farmaco viene introdotto nella soluzione del polimero finito. Viene quindi messo in uno stato gel.
Intrusione in strutture traslucide
L'essenza di questo metodo di immobilizzazione è la separazione di una soluzione acquosa di enzimi dal substrato. Per questo viene utilizzata una membrana semipermeabile. Permette il passaggio di elementi a basso peso molecolare di cofattori e substrati e trattiene grandi molecole di enzimi.
Microincapsulamento
Ci sono diverse opzioni per l'incorporamento in strutture traslucide. Di questi, il più grande interesse è la microincapsulazione e l'incorporazione di proteine nei liposomi. La prima opzione fu proposta nel 1964 da T. Chang. Consiste nel fatto che la soluzione enzimatica viene introdotta in una capsula chiusa, le cui pareti sono fatte di semipermeabilipolimero. L'aspetto di una membrana sulla superficie è causato dalla reazione della policondensazione interfacciale dei composti. Uno di questi è disciolto nell'organico e l' altro nella fase acquosa. Un esempio è la formazione di una microcapsula ottenuta per policondensazione di alogenuro di acido sebacico (fase organica) ed esametilendiammina-1, 6 (rispettivamente, fase acquosa). Lo spessore della membrana è calcolato in centesimi di micrometro. La dimensione delle capsule è di centinaia o decine di micrometri.
Incorporazione nei liposomi
Questo metodo di immobilizzazione è vicino alla microincapsulazione. I liposomi sono presentati in sistemi lamellari o sferici di doppi strati lipidici. Questo metodo è stato utilizzato per la prima volta nel 1970. Per isolare i liposomi da una soluzione lipidica, il solvente organico viene evaporato. Il film sottile rimanente viene disperso in una soluzione acquosa in cui è presente l'enzima. Durante questo processo, si verifica l'autoassemblaggio delle strutture del doppio strato lipidico. Tali enzimi immobilizzati sono abbastanza popolari in medicina. Ciò è dovuto al fatto che la maggior parte delle molecole è localizzata nella matrice lipidica delle membrane biologiche. Gli enzimi immobilizzati inclusi nei liposomi sono il materiale di ricerca più importante in medicina, che consente di studiare e descrivere i modelli dei processi vitali.
Formazione di nuovi legami
L'immobilizzazione mediante la formazione di nuove catene covalenti tra enzimi e vettori è considerata il metodo più diffuso per ottenere biocatalizzatori industriali.destinazione. A differenza dei metodi fisici, questa opzione fornisce un legame irreversibile e forte tra la molecola e il materiale. La sua formazione è spesso accompagnata dalla stabilizzazione del farmaco. Allo stesso tempo, la posizione dell'enzima a una distanza dal primo legame covalente rispetto al vettore crea alcune difficoltà nell'attuazione del processo catalitico. La molecola è separata dal materiale per mezzo di un inserto. È spesso usato come agenti poli e bifunzionali. In particolare si tratta di idrazina, cianogeno bromuro, dialedruro glutarico, solforile cloruro, ecc. Ad esempio, per rimuovere la galattosiltransferasi si inserisce la seguente sequenza tra il vettore e l'enzima -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. In una tale situazione, nella struttura sono presenti un inserto, una molecola e un vettore. Tutti loro sono collegati da legami covalenti. Di fondamentale importanza è la necessità di introdurre nella reazione gruppi funzionali non essenziali per la funzione catalitica dell'elemento. Quindi, di regola, le glicoproteine sono attaccate al vettore non attraverso la proteina, ma attraverso la parte di carboidrati. Di conseguenza, si ottengono enzimi immobilizzati più stabili e attivi.
Cellule
I metodi sopra descritti sono considerati universali per tutti i tipi di biocatalizzatori. Questi includono, tra l' altro, cellule, strutture subcellulari, la cui immobilizzazione si è recentemente diffusa. Ciò è dovuto a quanto segue. Quando le cellule vengono immobilizzate, non è necessario isolare e purificare i preparati enzimatici o introdurre cofattori nelle reazioni. Di conseguenza, diventa possibilesistemi che eseguono processi continui multistadio.
Uso di enzimi immobilizzati
Nella medicina veterinaria, nell'industria e in altri settori economici, i farmaci ottenuti con i metodi di cui sopra sono piuttosto popolari. Gli approcci sviluppati nella pratica forniscono una soluzione ai problemi della somministrazione mirata di farmaci nell'organismo. Gli enzimi immobilizzati hanno permesso di ottenere farmaci ad azione prolungata con allergenicità e tossicità minime. Attualmente, gli scienziati stanno risolvendo i problemi associati alla bioconversione di massa ed energia utilizzando approcci microbiologici. Nel frattempo, anche la tecnologia degli enzimi immobilizzati fornisce un contributo significativo al lavoro. Le prospettive di sviluppo sembrano essere piuttosto ampie. Quindi, in futuro, uno dei ruoli chiave nel processo di monitoraggio dello stato dell'ambiente dovrebbe appartenere a nuovi tipi di analisi. In particolare, stiamo parlando di metodi bioluminescenti e di immunodosaggio enzimatico. Approcci avanzati sono di particolare importanza nella lavorazione delle materie prime lignocellulosiche. Gli enzimi immobilizzati possono essere usati come amplificatori di segnali deboli. Il centro attivo può essere sotto l'influenza di un vettore che è sottoposto a ultrasuoni, stress meccanico o soggetto a trasformazioni fitochimiche.
