Cosa sta alla base dell'ibridazione del DNA? Sebbene la sequenza di DNA a doppio filamento sia generalmente stabile in condizioni fisiologiche, la modifica di queste condizioni in laboratorio (tipicamente aumentando la temperatura ambiente) farà sì che le molecole si separino in singoli filamenti. Questi ultimi sono complementari tra loro, ma possono anche integrare altre sequenze presenti nel loro ambiente. L'abbassamento della temperatura ambiente consente alle molecole a filamento singolo di ricotturarsi o "ibridarsi" tra loro. Questo è il metodo di ibridazione del DNA.
Il concetto dal punto di vista della biologia molecolare
Gli scienziati coinvolti sia nella replicazione del DNA che nella trascrizione del DNA in RNA si affidano ai crossover nucleotidici e alle tecniche di biologia molecolare. Ciò include le macchie del sud e del nord, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la maggior parte degli approcci di ibridazione e sequenziamento del DNA-RNA.
Applicazione
L'ibridazione è la proprietà principale del nucleotidesequenze ed è utilizzato in numerosi metodi di biologia molecolare. La relazione genetica complessiva di due specie può essere determinata ibridando segmenti del loro DNA (ibridazione DNA-DNA). A causa delle somiglianze di sequenza tra organismi strettamente correlati, è necessaria una temperatura più elevata per fondere tali ibridi di DNA rispetto agli organismi più distanti. Vari metodi utilizzano l'ibridazione per determinare l'origine di un campione di DNA, inclusa la reazione a catena della polimerasi (PCR). In un altro metodo, brevi sequenze di DNA vengono ibridate con l'mRNA cellulare per identificare i geni espressi. Le aziende farmaceutiche stanno esplorando l'uso dell'RNA antisenso per legarsi all'mRNA indesiderato, impedendo al ribosoma di tradurre l'mRNA in proteine.
L'ibridazione DNA-DNA si riferisce generalmente a una tecnica di biologia molecolare che misura il grado di somiglianza genetica tra pool di sequenze di DNA. È comunemente usato per determinare la distanza genetica tra due organismi. È stato ampiamente utilizzato nella filogenesi e nella tassonomia.
Metodologia
Il DNA di un organismo è stato etichettato, quindi mescolato con DNA non etichettato che poteva essere paragonato ad esso. La miscela viene incubata per consentire ai filamenti di DNA di dissociarsi e quindi raffreddarsi per formare un DNA ibrido rigenerato a doppio filamento. Le sequenze ibridate con un alto grado di somiglianza si legheranno più strettamente e richiederanno più energia per separarle: cioè, si separano quando riscaldate a un livello più altotemperatura rispetto a sequenze dissimili, un processo noto come "fusione del DNA".
DNA che si scioglie
Valutando il profilo di fusione del DNA ibridato, il DNA a doppio filamento viene legato ad una cosiddetta "colonna" e la miscela risultante viene riscaldata. Ad ogni passaggio, la colonna viene lavata e le sequenze di DNA che si sciolgono diventano a filamento singolo e vengono lavate via dalla colonna. Le temperature alle quali il DNA marcato esce dalla colonna riflette la quantità di somiglianza tra le sequenze (e il pattern di ripiegamento automatico funge da controllo). Questi risultati vengono combinati per determinare il grado di somiglianza genetica tra gli organismi. Secondo la moderna microbiologia, l'ibridazione del DNA è impossibile senza comprendere queste cose.
Quando più specie di acido ribonucleico (o deossiribonucleico) vengono confrontate in questo modo, i valori di somiglianza consentono di collocare la specie nell'albero filogenetico. Pertanto, questo è uno dei possibili approcci per condurre la sistematica molecolare. Charles Sibley e John Ahlquist, i pionieri di questa tecnica, hanno utilizzato l'ibridazione DNA-DNA per studiare le relazioni filogenetiche degli uccelli (tassonomia Sibley-Ahlquist) e dei primati.
Importanza per la biologia
L'ibridazione DNA-DNA è il gold standard per distinguere le specie batteriche, con un valore di somiglianza superiore al 70%, indicando che i ceppi confrontati appartengono a specie diverse. Nel 2014 è stata proposta una soglia del 79% di somiglianza per separare una sottospecie batterica.
I critici sostengono che la tecnica non è accurata per confrontare specie strettamente correlate, poiché qualsiasi tentativo di misurare le differenze tra sequenze ortologhe tra organismi è sopraffatto dall'ibridazione di controparti paraloghe nel genoma di un organismo. Il sequenziamento del DNA e il confronto delle sequenze computazionali sono attualmente il metodo comunemente utilizzato per determinare la distanza genetica, sebbene questo approccio sia ancora utilizzato in microbiologia per aiutare a identificare i batteri.
Il modo attuale è condurre l'ibridazione DNA-DNA in silicone utilizzando genomi completamente o parzialmente sequenziati. Il GGDC sviluppato dal DSMZ è lo strumento conosciuto più accurato per il calcolo di valori simili a DDH. Tra gli altri miglioramenti algoritmici, risolve il problema delle sequenze paraloghe filtrandole accuratamente dalle corrispondenze tra due sequenze genomiche.
Metodo PESCE
L'ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica di laboratorio utilizzata per rilevare e sequenziare il DNA, spesso su uno specifico cromosoma.
Nel 1969, Joseph Gall e Mary Lou Pardu pubblicarono un articolo che dimostrava che le copie radioattive di una sequenza di DNA ribosomiale potevano essere utilizzate per rilevare sequenze di DNA complementari nel nucleo di un uovo di rana. Da queste osservazioni originali, molti perfezionamenti hanno aumentato la versatilità ela sensibilità della procedura a tal punto che l'ibridazione in situ ("in place", latino) è ora considerata uno strumento importante in citogenetica. (Il termine in situ è ora usato anche per riferirsi allo stadio iniziale della crescita del carcinoma, quando solo il tessuto epiteliale è coinvolto nel processo patologico.)
Sequenza di ibridazione fluorescente
Le sonde RNA possono essere progettate per qualsiasi gene o sequenza all'interno di un gene per visualizzare lncRNA e miRNA mRNA in tessuti e cellule. FISH viene utilizzato studiando il ciclo di riproduzione cellulare, in particolare l'interfase nucleare per eventuali anomalie cromosomiche. FISH consente di analizzare una vasta serie di casi d'archivio, è molto più facile identificare il cromosoma identificato creando una sonda con una base cromosomica artificiale che attirerà cromosomi simili.
Segnali di ibridazione per ciascuna sonda quando viene rilevata un'anomalia nucleare: ciascuna sonda di rilevamento di mRNA e lncRNA è composta da 20 coppie di oligonucleotidi, ciascuna coppia copre uno spazio di 40-50 bp. p. Le sonde utilizzano una chimica proprietaria per rilevare l'mRNA.
Ibridazione con sonde DNA
Le sonde sono spesso costituite da frammenti di DNA che sono stati isolati, purificati e amplificati per essere utilizzati nella progettazione del genoma umano. La dimensione del genoma umano è così grande rispetto alla lunghezza che può essere direttamente sequenziata che è necessario dividerlo inframmenti. In definitiva, questi frammenti sono stati ordinati digerendo una copia di ciascun frammento in unità ancora più piccole utilizzando endonucleasi sequenza-specifica per misurare le dimensioni di ciascun piccolo frammento utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando queste informazioni per determinare dove i frammenti grandi si sovrapponevano l'uno all' altro..
Per preservare gli elementi con le loro singole sequenze di DNA, i frammenti sono stati aggiunti a un sistema di popolazioni batteriche sempre ripetute. Popolazioni clonali di batteri, ciascuna delle quali mantiene un singolo cromosoma artificiale, sono immagazzinate in vari laboratori in tutto il mondo. I cromosomi artificiali (BAC) possono essere coltivati, estratti ed etichettati in qualsiasi laboratorio contenente una libreria. Le biblioteche genomiche prendono spesso il nome dalle istituzioni in cui sono state sviluppate. Un esempio è la libreria RPCI-11, dal nome del Roswell Cancer Institute di Buffalo (New York, USA). Questi frammenti costituiscono circa 100mila paia di basi e sono la base della maggior parte delle sonde FISH.
