Il metodo della coltura tissutale è uno dei principali strumenti della moderna biotecnologia, consentendo di risolvere problemi pratici di fisiologia, biochimica e genetica delle piante. La coltivazione artificiale del materiale viene effettuata a determinate condizioni: sterilizzazione, controllo della temperatura ed esposizione a un mezzo nutritivo speciale.
Essenza
Il metodo di coltura tissutale è la loro conservazione a lungo termine e/o la coltivazione artificiale in condizioni di laboratorio su un mezzo nutritivo. Questa tecnologia consente di creare un modello biologico per lo studio di vari processi nelle cellule che esistono al di fuori del corpo di piante, esseri umani e animali.
La riproduzione della coltura di tessuti vegetali si basa sulla proprietà della totipotenza - la capacità delle cellule di svilupparsi in un intero organismo. Negli animali, questo si realizza solo nelle uova fecondate (ad eccezione di alcuni tipi di celenterati).
Cronologia dello sviluppo
I primi tentativi di coltivare tessuti vegetali furono fatti da scienziati tedeschi a cavallo tra il XIX e il XX secolo. Nonostante il fatto che non avessero successo, furono formulate una serie di idee, che furono confermate in seguito.
Nel 1922, W. Robbins e W. Kotte, indipendentemente l'uno dall' altro, furono in grado di coltivare le punte delle radici di mais e pomodoro su un mezzo nutritivo artificiale. Uno studio dettagliato delle tecniche di coltura cellulare e tissutale iniziò negli anni '30. 20 ° secolo R. Gautre e F. White hanno dimostrato che con il trapianto periodico di colture di tessuti in un mezzo nutritivo fresco, possono crescere indefinitamente.
Nel 1959, 142 specie di piante venivano coltivate in condizioni di laboratorio. Nella seconda metà del XX sec. è iniziato anche l'uso di cellule disperse (separate).
Tipi di materiale di prova
Ci sono 2 tipi principali di colture di tessuti vegetali:
- Prodotto senza distruzione e preservando i tratti caratteristici inerenti a un organismo vivente.
- Estratto per degradazione (chimica, enzimatica o meccanica) dal tessuto primario. Può essere formato da una o più colture cellulari.
I seguenti metodi si distinguono per il metodo di coltivazione:
- sul "strato nutritivo", in cui una sostanza che stimola la crescita dei tessuti viene secreta dividendo cellule della stessa specie vegetale;
- usando il tessuto infermieristico accanto alle cellule in coltura;
- uso di un mezzo nutritivo da un gruppo di cellule in divisione isolato;
- Crescita di singole cellule singole in una microgoccia saturata nella composizione.
La coltivazione da singole cellule è irta di alcune difficoltà. Per "forzarli" artificialmente a dividersi, devono ricevere un segnale dalle cellule vicine che funzionano attivamente.
Uno dei principali tipi di tessuto per la ricerca fisiologica è il callo, che si verifica in presenza di fattori esterni avversi (di solito lesioni meccaniche). Hanno la capacità di perdere le caratteristiche specifiche inerenti al tessuto originale. Di conseguenza, le cellule del callo iniziano a dividersi attivamente e si formano parti della pianta.
Condizioni necessarie
Il successo del metodo di coltura di tessuti e cellule dipende dai seguenti fattori:
- Rispettare la sterilità. Per il trapianto vengono utilizzate scatole speciali con aria purificata fornita, dotate di lampade a raggi ultravioletti. Strumenti e materiali, vestiti e mani del personale devono essere sottoposti a trattamento asettico.
- L'uso di mezzi nutritivi appositamente selezionati contenenti fonti di carbonio ed energia (solitamente saccarosio e glucosio), micro e macronutrienti, regolatori della crescita (auxine, citochinine), vitamine (tiamina, riboflavina, acido ascorbico e pantotenico e altri).
- Conformità a temperatura (18-30°C), condizioni di luce e umidità (60-70%). La maggior parte delle colture di tessuti callosi vengono coltivate alla luce ambientale poiché non contengono cloroplasti, ma alcune piante richiedono la retroilluminazione.
Attualmente prontoformazioni commerciali (Murasige e Skoog, Gamborg ed Eveleg, White, Kao e Mikhailyuk e altri).
Pro e contro
I vantaggi del metodo di coltura cellulare e tissutale sono:
- buona riproducibilità dei risultati ottenuti;
- regolazione delle interazioni intercellulari;
- basso consumo di reagenti;
- omogeneità genetica delle linee cellulari;
- possibilità di meccanizzazione del processo di coltivazione;
- controllo sulle condizioni della gabbia;
- conservazione a bassa temperatura di colture vive.
Lo svantaggio di questa biotecnologia è:
- necessità di rispettare rigorose condizioni di asepsi;
- instabilità delle proprietà cellulari e possibilità di una loro indesiderata miscelazione;
- alto costo dei prodotti chimici;
- equivalenza incompleta di tessuti e cellule in coltura in un organismo vivente.
Applicazione
Metodo di coltura tissutale utilizzato per la ricerca:
- processi all'interno delle cellule (sintesi di DNA, RNA e proteine, metabolismo e influenza su di esso con l'aiuto di farmaci);
- reazioni intercellulari (il passaggio di sostanze attraverso le membrane cellulari, il lavoro del complesso ormone-recettore, la capacità delle cellule di aderire l'una all' altra, la formazione di strutture istologiche);
- interazioni con l'ambiente (assorbimento di nutrienti, trasmissione di infezioni, processi di origine e sviluppotumori e altri);
- risultati di manipolazioni genetiche con le cellule.
Le aree promettenti della biologia e della farmacologia, nello sviluppo delle quali viene utilizzata questa tecnologia, sono:
- ottenere erbicidi efficaci, regolatori di crescita per colture agronomiche, composti biologicamente attivi da utilizzare nella produzione di medicinali (alcaloidi, steroidi e altri);
- mutagenesi diretta, allevamento di nuovi ibridi, superamento dell'incompatibilità postgama;
- propagazione clonale, che permette di ottenere un gran numero di piante geneticamente identiche;
- allevamento di piante resistenti e prive di virus;
- crioconservazione del pool genetico;
- ricostruzione tissutale, creazione di fonti di cellule staminali (ingegneria tissutale).
