La colorazione di Gram è ampiamente utilizzata in microbiologia in quanto è uno dei modi più semplici per differenziare i batteri in base alla composizione della loro parete cellulare. Secondo Gram, tutti i batteri possono essere suddivisi in gram-positivi (Gram (+)) e gram-negativi (Gram (-)). Il metodo della colorazione di Gram è stato sviluppato nel 1884 e da allora non ha perso popolarità, sebbene sia stato modificato più volte.
Struttura a parete cellulare
La colorazione di Gram rivela se un batterio è Gram-positivo o Gram-negativo. La divisione dei batteri in Gram (+) e Gram (-) avviene in accordo con la struttura della loro parete cellulare.
La parete cellulare contiene la maggior quantità di peptidoglicano (murein) - una sostanza complessa, che include peptapeptide e glicano. Il glicano è costituito da residui alternati di N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico legati tra loro da β-1,legami 4-glicosidici. Il peptidoglicano fornisce il mantenimento della forma cellulare, la protezione osmotica e le funzioni antigeniche.
Principali differenze tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi
Diversi batteri hanno diversi spessori dello strato di peptidoglicano. Nei batteri classificati come gram-positivi varia da 15 a 80 nm, mentre nei gram-negativi va da 2 a 8 nm. Allo stesso tempo, i batteri Gram-negativi hanno una struttura speciale sotto lo strato di peptidoglicano, che i batteri Gram-positivi non hanno: lo spazio periplasmatico. Questo spazio è pieno di enzimi idrolitici: β-lattamasi, ribonucleasi 1, fosfatasi. Sono questi enzimi che sono responsabili della resistenza dei batteri Gram-negativi a molti antibiotici.
Lo strato di batteri Gram(-) peptidoglicano è legato al lipopolisaccaride, una struttura antigenica contenente endotossina. Nei batteri Gram(+), gli acidi teicoici svolgono funzioni simili.
I batteri Gram-negativi hanno una struttura aggiuntiva: la membrana esterna.
L'essenza del metodo di colorazione
Prima di iniziare a colorare, vengono preparati gli strisci dei batteri studiati. Per fare ciò, l'acqua viene gocciolata su un vetrino e vi viene aggiunta una coltura di microrganismi con un'ansa batterica. Quindi, dopo che l'acqua si è completamente asciugata, la macchia viene fissata: il vetrino viene trasportato più volte sulla fiamma del bruciatore. La colorazione di Gram è più efficace della colorazione di batteri vivi: le molecole di colorante si legano meglio alle cellule morte.
La colorazione avviene in più fasi:
- Piccoli pezzi di carta da filtro vengono posti su una macchia fissa e viene versato il colorante principale: viola genziana o blu di metilene.
- Dopo 3-5 minuti, rimuovere la carta da filtro colorata e riempire lo striscio con la soluzione di Lugol per 1 minuto. In questo caso, la preparazione si scurisce.
- La soluzione di Lugol viene sgocciolata e lo striscio viene trattato con alcol etilico puro: alcune gocce vengono gocciolate sul preparato, sgocciolato dopo 20 secondi. La procedura viene ripetuta 2-3 volte.
- Risciacquare il vetrino di prova con acqua distillata.
- Produci ulteriore colorazione - rifinisci la preparazione con fucsina. Dopo 1-2 minuti, il colorante viene lavato via.
- Dopo che l'acqua si è asciugata, esamina la macchia al microscopio. I batteri Gram-positivi saranno blu-viola, i batteri Gram-negativi saranno rosa o rossi.
Cause dei diversi modelli di colorazione
Come descritto sopra, la colorazione Gram dei batteri colora i batteri Gram-positivi blu-viola, mentre i batteri Gram-negativi si colorano di rosso o rosa. Il motivo della colorazione differenziale dei batteri con questo metodo è che dopo che la forma solubile di violetta di genziana è entrata nella cellula, il colorante passa nella forma di iodio insolubile. Durante il trattamento dei batteri con alcol etilico, i lipidi vengono estratti dalla membrana sotto l'azione di questo solvente non polare. La membrana diventa quindi porosa e non costituisce più una barriera significativa alla lisciviazione del colorante. Tuttaviail peptidoglicano è più resistente ai solventi non polari, compreso l'alcol. È lui che impedisce il lavaggio del colorante, quindi i batteri con uno spesso strato di murein diventano blu-viola (gram-positivi) e dopo il trattamento con alcol non cambiano colore.
Lo strato sottile di mureina di batteri gram-negativi non può trattenere le molecole coloranti nella cellula, quindi dopo l'azione dell'alcol diventano incolori - colorano gram-negativi.
Dopo l'esposizione di uno striscio alla fucsina, i batteri colorati di Gram rimangono blu-viola, mentre i batteri Gram-negativi diventano rosa-rosso.
Esempi di batteri Gram(+) e Gram(-)
I batteri Gram-negativi includono cianobatteri, batteri dello zolfo, batteri del ferro, clamidia, rickettsia, batteri acetici, molti metilobatteri, batteri tionici, arsenitobatteri, carbossibatteri.
I bifidobatteri, molti batteri acquatici, streptococchi e stafilococchi sono Gram-positivi.
