Le proteine sono un componente essenziale di tutti gli organismi. Ciascuna delle sue molecole è costituita da una o più catene polipeptidiche costituite da amminoacidi. Sebbene le informazioni necessarie per la vita siano codificate nel DNA o nell'RNA, le proteine ricombinanti svolgono un'ampia gamma di funzioni biologiche negli organismi, tra cui la catalisi enzimatica, la protezione, il supporto, il movimento e la regolazione. In base alle loro funzioni nell'organismo, queste sostanze possono essere suddivise in diverse categorie, come anticorpi, enzimi, componenti strutturali. Date le loro importanti funzioni, tali composti sono stati studiati intensamente e ampiamente utilizzati.
In passato, il modo principale per ottenere una proteina ricombinante era isolarla da una fonte naturale, che di solito è inefficiente e richiede molto tempo. I recenti progressi nella tecnologia molecolare biologica hanno reso possibile clonare il DNA che codifica un insieme specifico di sostanze in un vettore di espressione per sostanze come batteri, lieviti, cellule di insetti e cellule di mammiferi.
In parole povere, le proteine ricombinanti vengono tradotte in prodotti esogeni di DNAcellule viventi. Per ottenerli di solito sono necessari due passaggi principali:
- Clonare una molecola.
- Espressione proteica.
Attualmente, la produzione di una tale struttura è uno dei metodi più potenti utilizzati in medicina e biologia. La composizione ha un'ampia applicazione nella ricerca e nella biotecnologia.
Direzione medica
Le proteine ricombinanti forniscono importanti trattamenti per varie malattie come diabete, cancro, malattie infettive, emofilia e anemia. Le formulazioni tipiche di tali sostanze includono anticorpi, ormoni, interleuchine, enzimi e anticoagulanti. Vi è una crescente necessità di formulazioni ricombinanti per uso terapeutico. Consentono di ampliare i metodi di trattamento.
Le proteine ricombinanti geneticamente modificate svolgono un ruolo chiave nel mercato dei farmaci terapeutici. Le cellule dei mammiferi attualmente producono gli agenti più terapeutici perché le loro formulazioni sono in grado di produrre sostanze naturali di alta qualità. Inoltre, in E. coli vengono prodotte molte proteine terapeutiche ricombinanti approvate grazie alla buona genetica, alla rapida crescita e all'elevata produttività. Ha anche un effetto positivo sullo sviluppo di farmaci a base di questa sostanza.
Ricerca
L'ottenimento di proteine ricombinanti si basa su metodi diversi. Le sostanze aiutano a scoprire i principi di base e fondamentali del corpo. Queste molecole possono essere utilizzate per identificare e determinareposizione della sostanza codificata da un particolare gene e per rivelare la funzione di altri geni in varie attività cellulari come segnalazione cellulare, metabolismo, crescita, replicazione e morte, trascrizione, traduzione e modifica dei composti discussi nell'articolo.
Così, la composizione osservata è spesso usata in biologia molecolare, biologia cellulare, biochimica, studi strutturali e biofisici e molti altri campi della scienza. Allo stesso tempo, ottenere proteine ricombinanti è una pratica internazionale.
Tali composti sono strumenti utili per comprendere le interazioni intercellulari. Si sono dimostrati efficaci in diversi metodi di laboratorio come ELISA e immunoistochimica (IHC). Le proteine ricombinanti possono essere utilizzate per sviluppare saggi enzimatici. Se utilizzate in combinazione con una coppia di anticorpi appropriati, le cellule possono essere utilizzate come standard per le nuove tecnologie.
Biotecnologie
Le proteine ricombinanti contenenti una sequenza di amminoacidi sono utilizzate anche nell'industria, nella produzione alimentare, nell'agricoltura e nella bioingegneria. Ad esempio, nella zootecnia, gli enzimi possono essere aggiunti al cibo per aumentare il valore nutritivo degli ingredienti dei mangimi, ridurre i costi e gli sprechi, sostenere la salute dell'intestino degli animali, migliorare la produttività e migliorare l'ambiente.
Inoltre, batteri lattici (LAB) per molto temposono stati utilizzati per produrre alimenti fermentati e recentemente è stato sviluppato LAB per l'espressione di proteine ricombinanti contenenti una sequenza di amminoacidi, che possono essere ampiamente utilizzate, ad esempio, per migliorare la digestione umana, animale e nutrizionale.
Tuttavia, anche queste sostanze hanno dei limiti:
- In alcuni casi, la produzione di proteine ricombinanti è complessa, costosa e richiede tempo.
- Le sostanze prodotte nelle cellule potrebbero non corrispondere alle forme naturali. Questa differenza può ridurre l'efficacia delle proteine ricombinanti terapeutiche e persino causare effetti collaterali. Inoltre, questa differenza può influenzare i risultati degli esperimenti.
- Il problema principale con tutti i farmaci ricombinanti è l'immunogenicità. Tutti i prodotti biotecnologici possono mostrare una qualche forma di immunogenicità. È difficile prevedere la sicurezza di nuove proteine terapeutiche.
In generale, i progressi della biotecnologia hanno aumentato e facilitato la produzione di proteine ricombinanti per una varietà di applicazioni. Sebbene presentino ancora alcuni inconvenienti, le sostanze sono importanti in medicina, ricerca e biotecnologia.
Link alla malattia
Le proteine ricombinanti non sono dannose per l'uomo. È solo una parte integrante della molecola complessiva nello sviluppo di un particolare farmaco o elemento nutritivo. Molti studi medici hanno dimostrato che l'espressione forzata della proteina FGFBP3 (abbreviata BP3) in un ceppo di laboratorio di topi obesi ha mostrato una significativa riduzione del grasso corporeo.massa, nonostante la predisposizione genetica all'uso.
I risultati di questi studi mostrano che la proteina FGFBP3 può offrire una nuova terapia per i disturbi associati alla sindrome metabolica come il diabete di tipo 2 e la steatosi epatica. Ma poiché la BP3 è una proteina naturale e non un farmaco artificiale, gli studi clinici sulla BP3 ricombinante umana potrebbero iniziare dopo il round finale di studi preclinici. Su, cioè, ci sono ragioni legate alla sicurezza di condurre tali studi. La proteina ricombinante non è dannosa per l'uomo grazie alla sua elaborazione e purificazione graduale. Cambiamenti stanno avvenendo anche a livello molecolare.
PD-L2, uno degli attori chiave dell'immunoterapia, è stato nominato per il Premio Nobel 2018 per la Fisiologia o la Medicina. Questo lavoro, iniziato dal Prof. James P. Allison dagli Stati Uniti e dal Prof. Tasuku Honjo dal Giappone, ha portato al trattamento di tumori come il melanoma, il cancro ai polmoni e altri basati sull'immunoterapia del checkpoint. Di recente, AMSBIO ha aggiunto un nuovo importante prodotto alla sua linea di immunoterapia, l'attivatore PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
Negli esperimenti di proof-of-concept, i ricercatori dell'Università dell'Alabama a Birmingham, guidati da H. Long Zheng, MD, dal professor Robert B. Adams e dal direttore di medicina di laboratorio, dipartimento di patologia, UAB School of Medicina, hanno evidenziato una potenziale terapia un disturbo emorragico raro ma fatale, TTP.
I risultati di questostudi dimostrano per la prima volta che la trasfusione di piastrine caricate con rADAMTS13 può essere un approccio terapeutico nuovo e potenzialmente efficace per la trombosi arteriosa associata a TTP congenita e immuno-mediata.
Le proteine ricombinanti non sono solo un nutriente, ma anche un farmaco nella composizione del farmaco in fase di sviluppo. Questi sono solo alcuni degli ambiti che oggi interessano la medicina e legati allo studio di tutti i suoi elementi strutturali. Come dimostra la pratica internazionale, la struttura di una sostanza permette a livello molecolare di affrontare molti gravi problemi del corpo umano.
Sviluppo del vaccino
Una proteina ricombinante è un insieme specifico di molecole che possono essere modellate. Una proprietà simile viene utilizzata nello sviluppo di vaccini. Una nuova strategia di vaccinazione, nota anche come l'uso di una speciale iniezione di virus ricombinante, potrebbe proteggere milioni di polli a rischio da una grave malattia respiratoria, hanno affermato i ricercatori dell'Università di Edimburgo e del Pirbright Institute. Questi vaccini utilizzano versioni innocue o deboli di virus o batteri per introdurre germi nelle cellule del corpo. In questo caso, gli esperti hanno utilizzato virus ricombinanti con diverse proteine spike come vaccini per creare due versioni di un virus innocuo. Ci sono molti farmaci diversi costruiti attorno a questa connessione.
I nomi commerciali e gli analoghi delle proteine ricombinanti sono i seguenti:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Si tratta principalmente di farmaci antitumorali, ma ci sono altre aree di trattamento associate a questo principio attivo.
Un nuovo vaccino, chiamato anche LASSARAB, progettato per proteggere le persone sia dalla febbre di Lassa che dalla rabbia, ha mostrato risultati promettenti negli studi preclinici, secondo un nuovo studio pubblicato sulla rivista scientifica Nature Communications. Un candidato vaccino ricombinante inattivato utilizza un virus della rabbia indebolito.
Il team di ricerca ha inserito il materiale genetico del virus Lassa in un vettore del virus della rabbia in modo che il vaccino esprimesse le proteine di superficie sia nelle cellule di Lassa che in quelle della rabbia. Questi composti di superficie suscitano una risposta immunitaria contro gli agenti infettivi. Questo vaccino è stato quindi inattivato per "distruggere" il virus della rabbia vivo utilizzato per creare il vettore.
Metodi di acquisizione
Ci sono diversi sistemi per produrre una sostanza. Il metodo generale per ottenere una proteina ricombinante si basa sull'ottenimento di materiale biologico dalla sintesi. Ma ci sono altri modi.
Attualmente ci sono cinque principali sistemi di espressione:
- Sistema di espressione di E.coli.
- Sistema di espressione del lievito.
- Sistema di espressione delle cellule di insetti.
- Sistema di espressione cellulare di mammifero.
- Sistema di espressione proteica privo di cellule.
Quest'ultima opzione è particolarmente adatta per l'espressione di proteine transmembranae composti tossici. Negli ultimi anni, sostanze difficili da esprimere con i metodi intracellulari convenzionali sono state integrate con successo nelle cellule in vitro. In Bielorussia è ampiamente utilizzata la produzione di proteine ricombinanti. Esistono numerose imprese statali che si occupano di questo problema.
Il sistema di sintesi proteica senza cellule è un metodo rapido ed efficiente per sintetizzare sostanze bersaglio aggiungendo vari substrati e composti energetici necessari per la trascrizione e la traduzione nel sistema enzimatico degli estratti cellulari. Negli ultimi anni sono emersi gradualmente i vantaggi dei metodi cell-free per tipi di sostanze come membrane complesse e tossiche, dimostrando la loro potenziale applicazione in campo biofarmaceutico.
La tecnologia senza cellule può aggiungere una varietà di amminoacidi non presenti in natura facilmente e in modo controllato per ottenere processi di modifica complessi che sono difficili da risolvere dopo l'espressione ricombinante convenzionale. Tali metodi hanno un elevato valore applicativo e potenziale per la somministrazione di farmaci e lo sviluppo di vaccini utilizzando particelle simili a virus. Un gran numero di proteine di membrana è stato espresso con successo in cellule libere.
Espressione di composizioni
La proteina ricombinante CFP10-ESAT 6 viene prodotta e utilizzata per creare vaccini. Un tale allergene della tubercolosi consente di rafforzare il sistema immunitario e sviluppare anticorpi. In generale, gli studi molecolari implicano lo studio di qualsiasi aspetto di una proteina, come struttura, funzione, modificazioni, localizzazione o interazioni. Esplorarecome sostanze specifiche regolano i processi interni, i ricercatori di solito richiedono i mezzi per produrre composti funzionali di interesse e beneficio.
Date le dimensioni e la complessità delle proteine, la sintesi chimica non è un'opzione praticabile per questo sforzo. Invece, le cellule viventi e il loro macchinario cellulare sono solitamente usati come fabbriche per creare e costruire sostanze basate sui modelli genetici forniti. Il sistema di espressione della proteina ricombinante genera quindi la struttura necessaria per creare un farmaco. Poi viene la selezione del materiale necessario per le diverse categorie di farmaci.
A differenza delle proteine, il DNA è facile da costruire sinteticamente o in vitro utilizzando tecniche ricombinanti consolidate. Pertanto, i modelli di DNA di geni specifici, con o senza l'aggiunta di sequenze reporter o sequenze di tag di affinità, possono essere progettati come modelli per l'espressione della sostanza monitorata. Tali composti derivati da tali modelli di DNA sono chiamati proteine ricombinanti.
Le strategie tradizionali per l'espressione di una sostanza implicano la trasfettazione delle cellule con un vettore di DNA che contiene un modello e quindi la coltura delle cellule per trascrivere e tradurre la proteina desiderata. Tipicamente, le cellule vengono quindi lisate per estrarre il composto espresso per la successiva purificazione. La proteina ricombinante CFP10-ESAT6 viene elaborata in questo modo e passa attraverso un sistema di purificazione da eventualila formazione di tossine. Solo dopo viene sintetizzato in un vaccino.
I sistemi di espressione in vivo per sostanze molecolari sia procariotici che eucariotici sono ampiamente utilizzati. La scelta del sistema dipende dal tipo di proteina, dal requisito per l'attività funzionale e dalla resa desiderata. Questi sistemi di espressione includono mammiferi, insetti, lieviti, batteri, alghe e cellule. Ogni sistema ha i suoi vantaggi e sfide, e la scelta del sistema giusto per una particolare applicazione è importante per l'espressione di successo della sostanza in esame.
Espressione dai mammiferi
L'uso di proteine ricombinanti permette lo sviluppo di vaccini e farmaci di vario livello. Per questo, è possibile utilizzare questo metodo per ottenere una sostanza. I sistemi di espressione dei mammiferi possono essere utilizzati per produrre proteine del regno animale che hanno la struttura e l'attività più autoctone a causa del loro ambiente fisiologicamente rilevante. Ciò si traduce in alti livelli di elaborazione post-traduzionale e attività funzionale. I sistemi di espressione dei mammiferi possono essere utilizzati per produrre anticorpi, proteine complesse e composti da utilizzare nei saggi funzionali cellulari. Tuttavia, questi vantaggi sono associati a condizioni culturali più rigorose.
I sistemi di espressione dei mammiferi possono essere utilizzati per generare proteine transitoriamente o attraverso linee cellulari stabili in cui il costrutto di espressione è integrato nel genoma ospite. Sebbene tali sistemi possano essere utilizzati in più esperimenti, il tempola produzione può generare una grande quantità di sostanza in una o due settimane. Questo tipo di biotecnologia proteica ricombinante è molto richiesta.
Questi sistemi di espressione di mammiferi transitori e ad alto rendimento utilizzano colture in sospensione e possono produrre grammi per litro. Inoltre, queste proteine hanno più ripiegamento nativo e modificazioni post-traduzionali come la glicosilazione rispetto ad altri sistemi di espressione.
Espressione di insetti
I metodi per la produzione di proteine ricombinanti non si limitano ai mammiferi. Esistono anche modalità più produttive in termini di costi di produzione, sebbene la resa della sostanza per 1 litro di liquido trattato sia molto inferiore.
Le cellule degli insetti possono essere utilizzate per esprimere una proteina di alto livello con modifiche simili ai sistemi dei mammiferi. Esistono diversi sistemi che possono essere utilizzati per generare baculovirus ricombinante, che possono quindi essere utilizzati per estrarre la sostanza di interesse nelle cellule degli insetti.
Le espressioni di proteine ricombinanti possono essere facilmente ampliate e adattate a colture in sospensione ad alta densità per la composizione di molecole su larga scala. Sono più funzionalmente simili alla composizione nativa della materia dei mammiferi. Sebbene la resa possa arrivare fino a 500 mg/L, la produzione di baculovirus ricombinante può richiedere molto tempo e le condizioni di coltura sono più difficili dei sistemi procariotici. Tuttavia, nei paesi più meridionali e più caldi, una situazione similemetodo è considerato più efficiente.
Espressione batterica
La produzione di proteine ricombinanti può essere stabilita con l'aiuto dei batteri. Questa tecnologia è molto diversa da quelle descritte sopra. I sistemi di espressione delle proteine batteriche sono popolari perché i batteri sono facili da coltivare, crescono rapidamente e danno rese elevate della formulazione ricombinante. Tuttavia, le sostanze eucariotiche multidominio espresse nei batteri sono spesso non funzionali perché le cellule non sono attrezzate per eseguire le necessarie modifiche post-traduzionali o il ripiegamento molecolare.
Inoltre, molte proteine diventano insolubili come molecole di inclusione, che sono molto difficili da recuperare senza denaturatori aggressivi e successive complicate procedure di ripiegamento molecolare. Questo metodo è per lo più considerato ancora in gran parte sperimentale.
Espressione cellulare
La proteina ricombinante contenente la sequenza aminoacidica della stafilochinasi si ottiene in modo leggermente diverso. È incluso in molti tipi di iniezioni, che richiedono diversi sistemi prima dell'uso.
L'espressione proteica priva di cellule è una sintesi in vitro di una sostanza che utilizza estratti cellulari interi compatibili traslazionalmente. In linea di principio, gli estratti di cellule intere contengono tutte le macromolecole e i componenti necessari per la trascrizione, la traduzione e persino la modifica post-traduzionale.
Questi componenti includono RNA polimerasi, fattori proteici regolatori, forme di trascrizione, ribosomi e tRNA. Quando si aggiungecofattori, nucleotidi e uno specifico modello genetico, questi estratti possono sintetizzare proteine di interesse in poche ore.
Sebbene non siano sostenibili per la produzione su larga scala, i sistemi di espressione proteica (IVT) senza cellule o in vitro offrono una serie di vantaggi rispetto ai sistemi in vivo convenzionali.
L'espressione senza cellule consente una rapida sintesi di formulazioni ricombinanti senza coinvolgere la coltura cellulare. I sistemi cell-free consentono di etichettare le proteine con amminoacidi modificati, nonché di esprimere composti che subiscono una rapida degradazione proteolitica da parte delle proteasi intracellulari. Inoltre, è più facile esprimere molte proteine diverse contemporaneamente utilizzando un metodo privo di cellule (ad esempio, testando le mutazioni proteiche mediante l'espressione su piccola scala da molti diversi modelli di DNA ricombinante). In questo esperimento rappresentativo, il sistema IVT è stato utilizzato per esprimere la proteina umana caspasi-3.
Conclusioni e prospettive future
La produzione di proteine ricombinanti ora può essere vista come una disciplina matura. Questo è il risultato di numerosi miglioramenti incrementali nella purificazione e nell'analisi. Attualmente, i programmi di scoperta di farmaci vengono raramente interrotti a causa dell'incapacità di produrre la proteina bersaglio. Processi paralleli per l'espressione, la purificazione e l'analisi di diverse sostanze ricombinanti sono ora ben noti in molti laboratori in tutto il mondo.
Complessi proteici e crescente successo nella produzionele strutture della membrana solubilizzata richiederanno più modifiche per stare al passo con la domanda. L'emergere di efficaci organizzazioni di ricerca a contratto per una fornitura più regolare di proteine consentirà la riallocazione delle risorse scientifiche per affrontare queste nuove sfide.
Inoltre, flussi di lavoro paralleli dovrebbero consentire la creazione di librerie complete della sostanza monitorata per consentire l'identificazione di nuovi bersagli e screening avanzato, insieme ai tradizionali progetti di scoperta di farmaci a piccole molecole.
