Coltivazione dei batteri: metodi, principi, passaggi e condizioni

2024 Autore: Angel Austin | [email protected]. Ultima modifica: 2023-12-17 05:31

I microrganismi nella natura che ci circonda sono ovunque: nei suoli, nei corpi idrici, sulle superfici di vari oggetti, le persone e gli animali sono abitati da loro. Tutto ciò può fungere da fonte di contaminazione microbica di alimenti, farmaci e linee di produzione. La coltivazione dei batteri è necessaria per studiarne le proprietà, i bisogni e le caratteristiche. Questo, a sua volta, è un passo importante nello sviluppo di vari farmaci, nella diagnosi di laboratorio delle malattie, nel calcolo dei reattori di produzione e molto altro ancora.

Concetti generali

La coltivazione di batteri in microbiologia si riferisce alla coltivazione di microrganismi effettuata in laboratorio. A loro volta, i microbi che sono cresciuti su un mezzo nutritivo selezionato sono chiamati coltura. Le colture possono essere miste se sono formate da diversi tipi di microrganismi e pure se sono rappresentate da un solo tipo di batteri.

Se nutritivoSolo una cellula viene posta nel mezzo e come risultato della sua riproduzione si ottiene un gruppo di individui, quindi questo insieme di microrganismi viene chiamato clone. Quando un clone si sviluppa al punto da diventare visibile ad occhio nudo, questa raccolta di batteri viene chiamata colonia.

Di solito la coltivazione di batteri isolati da diverse fonti viene effettuata separatamente l'uno dall' altro. Ciascuno di questi gruppi di microbi coltivati separatamente è chiamato ceppo. Quindi, se un tipo di stafilococco viene isolato da tre fonti (o porzioni diverse dello stesso prodotto, persone diverse), si parla di tre ceppi di questo tipo di stafilococco.

Fattori di crescita dei batteri

Questi includono vari aminoacidi, lipidi, basi puriniche e altri composti necessari per lo sviluppo di microrganismi. Alcuni microbi possono produrre autonomamente le sostanze di cui hanno bisogno, mentre altri devono riceverle in forma finita. In base alle esigenze dei microrganismi in determinati fattori di crescita, vengono eseguite l'identificazione e la differenziazione dei batteri. Inoltre, questo parametro è importante per la corretta preparazione di un mezzo nutritivo per il lavoro di laboratorio e biotecnologico:

• Aminoacidi. I batteri possono richiedere un particolare amminoacido o gruppo di acidi. Quindi, i clostridi hanno bisogno di leucina e tirosina, gli streptococchi hanno bisogno di leucina e arginina. I microrganismi che richiedono aminoacidi dall'esterno per crescere sono chiamati auxotrofi.
• Basi purine e pirimidiniche, nonché loro derivati (adenina, guanina e altri). Sono un fattore importante nella crescita di moltiSpecie Streptococcus.
• Vitamine. Fanno parte dei coenzimi richiesti dai batteri. Quindi, l'acido nicotinico, così come la sua ammide, che fanno parte di NAD e NADP, è necessario per la difterite e la shigella corynebacteria. La tiamina, come parte integrante del pirofosfato, è richiesta da Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. L'acido pantotenico, che fa parte del coenzima CoA, è richiesto dai bacilli del tetano e da alcuni tipi di streptococco. I citocromi, e quindi l'acido folico, gli emi e la biotina che li formano, sono necessari per il Mycobacterium tuberculosis e l'Haemophilus influenzae.

Requisiti ambientali

Condizioni per i terreni di coltura per la coltura di batteri:

1. Nutrizione. Devono contenere sostanze, inoltre, in forma facilmente digeribile, necessarie ai microrganismi per nutrirsi e reintegrare energia. Questi includono organogeni e minerali. Alcuni microrganismi richiedono inoltre vitamine e aminoacidi che non sono in grado di sintetizzare.
2. Livello di pH ottimale. Colpisce la permeabilità della membrana cellulare e, di conseguenza, la capacità di assorbire i nutrienti da parte del batterio. Molto spesso, il valore del pH dovrebbe essere al livello di 7, 2–7, 4. Molti microrganismi nel corso della loro vita producono prodotti con reazioni acide o alcaline e, affinché il pH del mezzo nutritivo non cambi, deve essere memorizzato nel buffer.
3. Isotonico. La pressione osmotica nel mezzo nutritivo per la coltivazione dei batteri dovrebbe avere gli stessi valori diall'interno delle cellule microbiche. Di solito corrisponde a una soluzione di NaCl allo 0,5%.
4. Sterilità. Ciò è dovuto al fatto che la comparsa di batteri estranei distorcerà i risultati dello studio del ceppo analizzato.
5. Livello di umidità. Questo indicatore, insieme alla consistenza del terreno, dovrebbe avere caratteristiche ottimali per un particolare tipo di batterio.
6. Potenziale redox (RH2). Mostra il rapporto tra le sostanze che donano e accettano elettroni, nonché il livello di saturazione di ossigeno del mezzo nutritivo. Per aerobi e anaerobi, le condizioni per la coltivazione dei batteri differiscono leggermente in questo indicatore. I microrganismi anaerobici si riproducono meglio con valori di RH2 inferiori a 5 e i microrganismi aerobici almeno 10.
7. Uniformità. È importante che il mezzo di coltura contenga quantità costanti dei suoi singoli ingredienti. Inoltre, sono preferibili soluzioni chiare, che facilitano il monitoraggio della crescita delle colture o la rilevazione di contaminazioni.

Tipi di supporti culturali

La scelta di un terreno particolare per la crescita dei microrganismi è influenzata da molti fattori, tra cui le caratteristiche della loro alimentazione e lo scopo dello studio. Le caratteristiche principali alla base della classificazione dei mezzi nutritivi sono:

1. Componenti. In base alle sostanze iniziali utilizzate per creare il supporto, si distinguono:

• naturali, che sono preparati con prodotti di origine animale o vegetale (es. carne, latte, frutta) e sono adatti alla coltivazione mistacolture;
• semisintetico, in cui i costosi prodotti alimentari naturali sono sostituiti da prodotti non alimentari (ad esempio farina di ossa, coaguli di sangue) e che sono ottimali per coltivare determinati tipi di batteri o isolare i loro prodotti metabolici dal ambiente;
• sintetici, che sono preparati da quantità precise di composti chimici, hanno una composizione nota costante e sono facilmente riproducibili.

2. Consistenza (densità). Distinguere gli ambienti:

• liquido;
• denso;
• semiliquido.

Gli ultimi due sono preparati da soluzioni speciali o sostanze liquide con l'aggiunta di agar-agar o gelatina per creare la densità richiesta. Inoltre, un ambiente denso per la crescita dei batteri è costituito da siero di sangue coagulato, patate, gel di silice, carragenina.

3. Composto. Su questa base, gli ambienti sono:

• semplice, la cui lista è breve è Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), gelatina nutriente e acqua peptone.
• complesso, preparato da quelli semplici con l'aggiunta di sangue, siero di latte, carboidrati e altre sostanze.

4. Appuntamento. Si distinguono i seguenti mezzi nutritivi:

• principali sono usati per far crescere molti microbi patogeni (di solito di composizione semplice);
• quelli speciali servono per isolare e coltivare batteri che non crescono su semplici substrati;
• selettivi (sono anche selettivi) sono adatti per isolare un tipo specifico di batteri e inibire la crescita dei microbi associati (selettivitàcreato aggiungendo determinate sostanze ai media, come antibiotici o sali, o regolando il pH);
• la diagnostica differenziale permette di distinguere un tipo di batterio da un altro valutando l'attività enzimatica, ad esempio, del mezzo;
• I conservanti sono necessari per l'inoculazione iniziale con il successivo trasporto dei campioni, poiché impediscono la morte dei microrganismi e inibiscono la crescita di altri batteri.

Preparazione dei media

Il passaggio più importante nella coltivazione dei batteri anaerobici è la preparazione di un mezzo nutritivo adatto. Dopo aver selezionato i parametri ottimali, procedere alle fasi seguenti:

• pesare, selezionando un campione di componenti su una bilancia analitica;
• dissoluzione effettuata in acqua distillata riscaldata a 70°C, e fosfati, micro e macrosali vengono sciolti separatamente;
• bollire a bagnomaria per due minuti;
• Determinazione del pH mediante carta indicatrice o potenziometro;
• filtrazione attraverso un panno umido o filtri di carta per liquidi e liquidi densi fusi e attraverso un filtro di garza di cotone per mezzi agar;
• imbottigliamento eseguito a 3/4 di capacità;
• sterilizzazione a media dipendenza;
• Il controllo della sterilità viene effettuato mediante una sosta di due giorni in un termostato, seguita dalla visualizzazione;
• controllo chimico per stabilire il pH e il contenuto del necessarioarticoli;
• controllo biologico mediante inoculazione di prova.

Sterilizzazione di vetreria e supporti

Uno dei principi base della coltivazione batterica è la sterilità. La crescita e lo sviluppo di microrganismi estranei possono influenzare le caratteristiche del mezzo nutritivo modificandone la composizione chimica e il pH. La sterilizzazione è la condizione principale per la coltivazione di colture pure. In pratica, con questo termine si intendono i metodi di distruzione di assolutamente tutte le forme di vita sulla superficie e nel volume degli oggetti sterilizzati. I recipienti, gli strumenti utilizzati, i supporti e altri oggetti utilizzati durante lo studio vengono sterilizzati.

Alcuni tipi di sterilizzazione:

• Accensione. La sterilizzazione di anse e aghi per la semina, vetrini, alcuni strumenti possono essere eseguiti utilizzando un bruciatore o una lampada ad alcool.
• Ebollizione. Adatto per la manipolazione di siringhe, aghi, cibo, ma non uccide le spore batteriche.
• Sterilizzazione a calore secco. Viene eseguito in una speciale cabina di essiccazione ed è adatto per la lavorazione di flaconi, provette e altri articoli di vetreria da laboratorio.
• Sterilizzazione a vapore. Eseguito in autoclave, questo metodo è molto efficace. Ma non è adatto per mezzi nutritivi contenenti proteine o altri composti che si decompongono alle alte temperature. Più risparmio può essere chiamato tindalizzazione. Si svolge nella caldaia Koch e combina la germinazione delle spore con la loro distruzione.
• Pastorizzazione. Viene utilizzato per i media che cambiano le loro proprietà quando vengono bolliti (ad esempio latte, vino, birra), capaci diliberarli dai microrganismi non portatori di spore. La temperatura di lavorazione è di soli 50-60°C per quindici-trenta minuti. In alcuni casi si ricorre alla sterilizzazione a freddo, effettuata mediante filtri o raggi UV.

Condizioni di coltivazione dei batteri

La crescita e lo sviluppo dei batteri è possibile solo in base a determinati fattori e ai valori di ciascuno di essi:

1. Temperatura. Esistono tre gruppi di batteri che differiscono nelle preferenze di temperatura:

• I termofili, o microbi amanti del calore, crescono a 45-90°C, il che significa che non si moltiplicano negli organismi umani e animali;
• Gli psicofili, o microrganismi amanti del freddo, preferiscono temperature comprese tra 5-15°C e vengono coltivati in celle frigorifere;
• mesofili, si sviluppano ad una temperatura di 25-37°C, contengono la maggior parte dei batteri.

2. Leggero. È una caratteristica della coltivazione dei batteri fototrofici, poiché svolgono il processo fotosintetico. Ma per la maggior parte dei microbi, l'illuminazione non è un prerequisito. E anche viceversa, l'ultravioletto solare può sopprimere il loro sviluppo.

3. Acqua. Tutti i microrganismi hanno bisogno di acqua in una forma accessibile (liquida). Ecco perché gli alimenti surgelati hanno una crescita batterica minima o nulla.

4. Acidità dell'ambiente. Questo principio di coltivazione dei batteri è già stato discusso in dettaglio sopra.

5. Aerazione. L'ossigeno, in quanto elemento chimico, è parte integrante dell'acqua e per essa viene utilizzato un numero considerevole di composticoltivazione di microrganismi. L'ossigeno gassoso può anche essere contenuto nell'acqua e in altri liquidi in forma disciolta. Una parte significativa dei batteri necessita di un apporto costante di molecole di ossigeno. Ma per un certo numero di microrganismi non è necessario o, peggio, l'ossigeno gassoso è tossico per loro, poiché non hanno catalasi e perossidasi, che distruggono i prodotti respiratori tossici. Pertanto, il passaggio più importante nella coltivazione dei batteri anaerobici è la rimozione delle molecole O₂ dal mezzo nutritivo.

6. Coltivazione di microrganismi. La coltivazione di batteri aerobi e anaerobici viene effettuata in diversi strati dell'ambiente e in diverse modalità.

Coltivazione di microrganismi aerobici

La coltivazione di batteri aerobici richiede ossigeno molecolare. Per ottenere colture pure di aerobi che possono essere utilizzate con successo in medicina e nell'industria alimentare, vengono utilizzati i seguenti metodi:

• superficie che cresce su terreni densi o liquidi (il loro strato sottile) quando l'ossigeno arriva direttamente dall'aria;
• coltivazione profonda in mezzi liquidi, quando si ottiene un aumento della quantità di ossigeno disciolto in essi mediante un'aerazione costante.

Coltivazione di microrganismi anaerobici

Il principio di base della coltivazione di batteri di questo tipo è il loro minimo contatto con l'ossigeno atmosferico. Fornire le condizioni per la loro crescita è molto più difficile che per gli aerobi. I seguenti metodi vengono utilizzati per isolare gli anaerobi dalla molecola O₂:

1. Fisico. Questo metodo di coltivazione dei batteri anaerobici si riduce alla loro coltivazione in uno speciale apparato sottovuoto: un microanaerostato. L'aria al suo interno è sostituita da una speciale miscela di gas di azoto con l'aggiunta del 10% di idrogeno e del 5% di anidride carbonica.
2. Chimica. Questi includono: uso di agenti assorbenti (es. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) o agenti riducenti (come l'acido ascorbico).
3. Biologico. Si tratta della co-coltivazione di aerobi e anaerobi in un sistema chiuso. Questo metodo di coltivazione dei batteri prevede la semina di una metà di una capsula di Petri con alcune delle specie di batteri aerobi e l' altra metà con l'anaerobio studiato. Il suo sviluppo inizierà nel momento in cui tutto l'ossigeno sarà esaurito.

I seguenti metodi di semina sono adatti per la coltivazione di batteri anaerobici:

• nello strato superficiale;
• nello strato superficiale riempito con paraffina sterile;
• nello spessore di un mezzo nutriente denso;
• in strati profondi di materiale viscoso.

Ottenere cultura pura

I microbiologi di solito lavorano con campioni abitati da molti diversi tipi di microbi. Tuttavia, per determinare la posizione sistematica dei microrganismi (famiglia, genere, specie), nonché per studiarne le caratteristiche, è necessario isolarli e coltivare una coltura pura. Sono di grande importanza in molte industrie alimentari, ad esempio formaggio, pane, kvas, vino, ecc. La coltivazione dei batteri lattici permette di ottenereun componente essenziale per la produzione di prodotti a base di latte fermentato, pasta, cacao, insilati e persino plastica.

Il metodo per isolare una coltura pura in un mezzo denso si basa sulla separazione meccanica delle cellule di microrganismi con la loro successiva coltivazione isolata. Il campione viene trasferito in un volume sterile di acqua o soluzione fisiologica (volume 10-100 ml) e quindi agitato per due minuti. Per estrarre i microrganismi che si trovano nello spessore del materiale in studio (ad esempio salsicce o formaggi), si procede prima a strofinare i pezzi di campione con strumenti sterili con sabbia. Il materiale che ha subito una preparazione preliminare, del peso di 1 go un volume di 1 ml, viene diluito con acqua sterile per 10, 100, 1000, ecc. volte. Viene scelto il grado di diluizione che fornisce una concentrazione di cellule corrispondente alle capacità del metodo.

La successiva coltivazione di microrganismi serve per preparare un mezzo nutritivo. Di solito viene scelto un mezzo denso (MPA). Viene prima sciolto e raffreddato a 45-50 ° C, quindi solo dopo viene versato in diverse piastre Petri (da tre a cinque pezzi), sul fondo delle quali vengono posti dei tamponi della sostanza in esame di varie concentrazioni. Successivamente viene eseguita la miscelazione del mezzo nutritivo non ancora congelato e del materiale introdotto in esso. Questo è il modo in cui le celle vengono fissate in vari punti del volume del substrato.

Successivamente, le piastre Petri vengono poste in un termostato per 2 giorni a 22 °C. Durante questo periodo, le cellule si moltiplicano a tal punto che la colonia formata da ciascuna delle cellule diventa visibile ad occhio nudo. Ognuno di loro è una coltura pura del tipo di batteri dalle cui cellulerosa.

Successivamente, dalle piastre di Petri, i microrganismi vengono sottocoltivati in provette separate riempite con un mezzo nutritivo. In questo modo, le colture pure vengono isolate da un campione misto. Questo metodo porta il nome del suo sviluppatore - R. Koch. Viene anche comunemente chiamato metodo a tazza, o semina impoverente. Dopo aver ottenuto colture pure di vari tipi di batteri, si determina la loro forma, le spore e le famiglie.

Tutti i lavori devono essere eseguiti secondo i principi dell'asepsi. Per evitare lo sviluppo prematuro di microrganismi, lo studio deve essere effettuato immediatamente dopo il campionamento. L'acqua del rubinetto viene analizzata dopo aver scaricato le prime porzioni, poiché possono contenere microbi accumulati nelle tubazioni e nei rubinetti. La microflora di frutta, bacche e verdure si trova principalmente in superficie (buccia), quindi da essa vengono eseguiti i lavaggi. Per fare ciò, posizionare il feto in un contenitore sterile e riempirlo con la quantità d'acqua necessaria. Quindi vengono scossi abbastanza vigorosamente e l'acqua viene versata in un altro contenitore. Con i tamponi si ottengono anche raccolti di prodotti di stoffa, ma in anticipo vengono ritagliati pezzi di una determinata dimensione.