Gli analizzatori di sangue per ematologia sono i cavalli di battaglia dei laboratori clinici. Questi strumenti ad alte prestazioni forniscono conte affidabili di globuli rossi, piastrine e globuli bianchi a 5 componenti che identificano linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili e basofili. Il numero di eritrociti nucleari e granulociti immaturi sono il sesto e il settimo indicatore. Sebbene l'impedenza elettrica sia ancora fondamentale per la determinazione del numero e della dimensione cellulare totale, le tecniche di citometria a flusso si sono dimostrate utili nella differenziazione dei leucociti e nell'esame del sangue su un analizzatore di patologia ematologica.
Evoluzione dell'analizzatore
I primi quantificatori di sangue automatizzati introdotti negli anni '50 erano basati sul principio dell'impedenza elettrica di Coulter, in cuile cellule, passando attraverso un piccolo foro, rompevano il circuito elettrico. Questi erano analizzatori "preistorici" che contavano e calcolavano solo il volume medio degli eritrociti, l'emoglobina media e la sua densità media. Chiunque abbia mai contato le cellule sa che è un processo molto monotono e nessun tecnico potrà mai dare lo stesso risultato. Pertanto, il dispositivo ha eliminato questa variabilità.
Negli anni '70 entrano nel mercato gli analizzatori automatizzati, in grado di determinare 7 parametri ematici e 3 componenti della formula leucocitaria (linfociti, monociti e granulociti). Per la prima volta, il conteggio manuale dei leucogrammi è stato automatizzato. Già negli anni '80 uno strumento poteva calcolare 10 parametri. Gli anni '90 hanno visto ulteriori miglioramenti nei differenziali dei leucociti utilizzando metodi di flusso basati sull'impedenza elettrica o sulle proprietà di diffusione della luce.
I produttori di analizzatori ematologici spesso cercano di separare i loro strumenti dai prodotti della concorrenza concentrandosi su un particolare pacchetto di tecnologie di differenziazione dei globuli bianchi o di conteggio delle piastrine utilizzate. Tuttavia, gli esperti di diagnostica di laboratorio sostengono che la maggior parte dei modelli è difficile da distinguere, poiché utilizzano tutti metodi simili. Aggiungono solo funzionalità aggiuntive per farli sembrare diversi. Ad esempio, un analizzatore ematologico automatizzato può determinare i differenziali dei leucociti inserendo un colorante fluorescente nel nucleo.cellule e misurazioni della luminosità del bagliore. L' altro può modificare la permeabilità e registrare il tasso di assorbimento del colorante. Il terzo è in grado di misurare l'attività dell'enzima in una cellula posta in un substrato specifico. C'è anche un metodo di conduzione e dispersione volumetrica che analizza il sangue nel suo stato "quasi naturale".
Le nuove tecnologie si stanno muovendo verso metodi a flusso continuo, in cui le cellule vengono esaminate a turno da un sistema ottico in grado di misurare molti parametri mai misurati prima. Il problema è che ogni produttore vuole creare il proprio metodo per mantenere la propria identità. Pertanto, spesso eccellono in un'area e restano indietro in un' altra.
Stato attuale
Secondo gli esperti, tutti gli analizzatori ematologici sul mercato sono generalmente affidabili. Le differenze tra loro sono minori e si riferiscono a funzionalità aggiuntive che potrebbero piacere ad alcuni, ma ad altri no. Tuttavia, la decisione di acquistare uno strumento di solito dipende dal suo prezzo. Sebbene il costo non fosse un problema in passato, oggi l'ematologia sta diventando un mercato molto competitivo e talvolta il prezzo (piuttosto che la migliore tecnologia disponibile) influenza l'acquisto dell'analizzatore.
Gli ultimi modelli ad alte prestazioni possono essere utilizzati come strumento autonomo o come parte di un sistema multi-utensile automatizzato. Il laboratorio completamente automatizzato comprende analizzatori di ematologia, chimica e immunochimica con ingressi, uscite e refrigerazione automatizzatiimpostazioni.
Gli strumenti di laboratorio dipendono dal sangue da testare. I suoi diversi tipi richiedono moduli speciali. L'analizzatore ematologico in medicina veterinaria è configurato per lavorare con elementi uniformi di varie specie animali. Ad esempio, ProCyte Dx di Idexx può analizzare campioni di sangue di cani, gatti, cavalli, tori, furetti, conigli, gerbilli, maialini, porcellini d'India e maialini.
Applicazione dei principi di flusso
Gli analizzatori sono comparabili in alcune aree, in particolare nella determinazione del livello di leucociti ed eritrociti, emoglobina e piastrine. Questi sono indicatori ordinari, tipici, in gran parte gli stessi. Ma gli analizzatori ematologici sono esattamente gli stessi? Ovviamente no. Alcuni modelli si basano su principi di impedenza, alcuni utilizzano la diffusione della luce laser e altri utilizzano la citometria a flusso a fluorescenza. In quest'ultimo caso vengono utilizzati coloranti fluorescenti, che colorano le caratteristiche uniche delle cellule in modo che possano essere separate. Pertanto, diventa possibile aggiungere parametri aggiuntivi alle formule di leucociti ed eritrociti, incluso il conteggio del numero di eritrociti nucleati e granulociti immaturi. Un nuovo indicatore è il livello di emoglobina nei reticolociti, utilizzato per monitorare l'eritropoiesi e la frazione immatura delle piastrine.
Il progresso tecnologico sta iniziando a rallentare con l'emergere di intere piattaforme ematologiche. Ancora ci sono ancoranumerosi miglioramenti. Quasi standard ora è un esame emocromocitometrico completo con un conteggio degli eritrociti nucleati. Inoltre, è aumentata la precisione della conta piastrinica.
Un' altra funzione standard degli analizzatori di alto livello è determinare il numero di cellule nei fluidi biologici. Il conteggio del numero di leucociti ed eritrociti è una procedura laboriosa. Di solito viene eseguita manualmente su un emocitometro, richiede tempo e personale qualificato.
Il prossimo passo importante in ematologia è la determinazione della formula dei leucociti. Se gli analizzatori precedenti potevano solo marcare i blasti, i granulociti immaturi e i linfociti atipici, ora è necessario contarli. Molti analisti li menzionano sotto forma di indicatore di ricerca. Ma la maggior parte delle grandi aziende ci sta lavorando.
Gli analizzatori moderni forniscono buone informazioni quantitative ma non qualitative. Sono utili per contare le particelle e possono classificarle come globuli rossi, piastrine, globuli bianchi. Tuttavia, sono meno affidabili nelle stime qualitative. Ad esempio, l'analizzatore può determinare che si tratta di un granulocita, ma non sarà così accurato nel determinare il suo stadio di maturazione. La prossima generazione di strumenti da laboratorio dovrebbe essere in grado di misurarlo meglio.
Oggi, tutti i produttori hanno perfezionato la tecnologia del principio di impedenza Coulter e ottimizzato il loro software al punto da poter estrarre quanti più dati possibile. In futuro, nuovotecnologie che sfruttano la funzionalità della cellula, nonché la sintesi della sua proteina di superficie, che ne indica le funzioni e lo stadio di sviluppo.
Confine citometrico
Alcuni analizzatori utilizzano metodi di citometria a flusso, in particolare marcatori dell'antigene CD4 e CD8. Gli analizzatori ematologici Sysmex sono i più vicini a questa tecnologia. In definitiva, non dovrebbe esserci alcuna differenza tra i due, ma ciò richiede che qualcuno ne veda il vantaggio.
Un segno di possibile integrazione è che quelli che erano considerati test standard, che sono passati alla citometria a flusso, stanno tornando in auge in ematologia. Ad esempio, non sarebbe sorprendente se gli analizzatori potessero eseguire la conta dei globuli rossi fetali, sostituendo la tecnica manuale del test di Kleinhauer-Bethke. Il test può essere eseguito mediante citometria a flusso, ma il suo ritorno al laboratorio di ematologia gli darà un'accettazione più ampia. È probabile che nel lungo periodo questa terribile analisi in termini di accuratezza sarà più in linea con quanto ci si dovrebbe aspettare dalla diagnostica nel 21° secolo.
È probabile che la linea tra analizzatori ematologici e citometri a flusso cambi nel prossimo futuro con l'avanzare della tecnologia o delle metodologie. Un esempio è il conteggio dei reticolociti. È stato eseguito prima a mano, poi su un citometro a flusso, dopodiché è diventato uno strumento di ematologia quando la tecnica è stata automatizzata.
Prospettive di integrazione
Secondo gli esperti, alcuni semplicii test citometrici possono essere adattati per l'analizzatore ematologico. Un esempio ovvio è il rilevamento di sottoinsiemi regolari di cellule T, leucemia cronica o acuta diretta, in cui tutte le cellule sono omogenee con un profilo fenotipico molto chiaro. Negli analizzatori del sangue, è possibile determinare con precisione le caratteristiche di dispersione. I casi di popolazioni miste o veramente piccole con profili fenotipici insoliti o più aberranti possono essere più complessi.
Tuttavia, alcune persone dubitano che gli analizzatori del sangue ematologici diventeranno citometri a flusso. Il test standard costa molto meno e dovrebbe rimanere semplice. Se, a seguito della sua condotta, viene determinata una deviazione dalla norma, è necessario sottoporsi ad altri test, ma la clinica o lo studio medico non dovrebbero farlo. Se i test complessi vengono eseguiti separatamente, non aumenteranno il costo di quelli normali. Gli esperti sono scettici sul fatto che lo screening per la leucemia acuta complessa oi grandi pannelli utilizzati nella citometria a flusso tornino rapidamente al laboratorio di ematologia.
La citometria a flusso è costosa, ma ci sono modi per ridurre i costi combinando i reagenti in modi diversi. Un altro fattore che rallenta l'integrazione del test nell'analizzatore ematologico è la perdita di entrate. Le persone non vogliono perdere questa attività poiché i loro profitti sono già diminuiti.
Anche l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'analisi del flusso sono importanti da considerare. Metodi basati suimpedenza, sono cavalli di battaglia nei grandi laboratori. Devono essere affidabili e veloci. E devi assicurarti che siano convenienti. Il loro punto di forza risiede nell'accuratezza e nella riproducibilità dei risultati. E quando emergono nuove applicazioni nel campo della citometria cellulare, devono ancora essere provate e implementate. La tecnologia in linea richiede un buon controllo della qualità e la standardizzazione di strumenti e reagenti. Senza questo, gli errori sono possibili. Inoltre, è necessario disporre di personale formato che sappia cosa sta facendo e con cui lavora.
Secondo gli esperti, ci saranno nuovi indicatori che cambieranno l'ematologia di laboratorio. Quegli strumenti in grado di misurare la fluorescenza sono in una posizione molto migliore perché hanno un grado di sensibilità e selettività più elevato.
Software, regole e automazione
Mentre i visionari guardano al futuro, oggi i produttori sono costretti a combattere con i concorrenti. Oltre a evidenziare le differenze tecnologiche, le aziende differenziano i loro prodotti con un software che gestisce i dati e fornisce la convalida automatica delle celle normali sulla base di una serie di regole impostate in laboratorio, velocizzando notevolmente la convalida e dando al personale più tempo per concentrarsi sui casi anomali..
A livello di analizzatore, è difficile distinguere i vantaggi dei diversi prodotti. In una certa misura, disporre di un software che gioca un ruolo chiave nell'ottenere i risultati dell'analisi consente al prodotto di distinguersi nel mercato. Prima di tutto, vanno le aziende diagnostichecommercializzare software per proteggere la propria attività, ma poi si rendono conto che i sistemi di gestione delle informazioni sono essenziali per la loro sopravvivenza.
Con ogni generazione di analizzatori, il software migliora notevolmente. La nuova potenza di calcolo fornisce una selettività molto migliore nel calcolo manuale della formula dei leucociti. La possibilità di ridurre la quantità di lavoro con un microscopio è molto importante. Se esiste uno strumento accurato, è sufficiente esaminare le cellule patologiche su un analizzatore ematologico, che aumenta l'efficienza del lavoro degli specialisti. E i dispositivi moderni ti consentono di raggiungere questo obiettivo. Questo è esattamente ciò di cui il laboratorio ha bisogno: facilità d'uso, efficienza e lavoro ridotto al microscopio.
È preoccupante che alcuni medici di laboratorio clinici stiano concentrando i loro sforzi sul miglioramento della tecnologia piuttosto che sull'ottimizzazione per prendere decisioni mediche valide. Puoi acquistare lo strumento da laboratorio più bizzarro del mondo, ma se controlli costantemente i risultati, questo elimina le possibilità del tecnologo. Le anomalie non sono errori e i laboratori che convalidano automaticamente solo il risultato "Nessuna cellula anormale trovata" dall'analizzatore ematologico agiscono in modo illogico.
Ogni laboratorio dovrebbe definire i criteri per i quali i test dovrebbero essere rivisti e quali dovrebbero essere elaborati manualmente. Pertanto, l'importo totale del lavoro non automatizzato viene ridotto. C'è un tempo per lavorare con l'anormaleleucogrammi.
Il software consente ai laboratori di impostare regole per l'auto-validazione e l'identificazione di campioni sospetti in base alla posizione del campione o del gruppo di studio. Ad esempio, se il laboratorio elabora un gran numero di campioni di cancro, il sistema può essere configurato per analizzare automaticamente il sangue su un analizzatore di patologia ematologica.
È importante non solo confermare automaticamente i risultati normali, ma anche ridurre il numero di falsi positivi. L'analisi manuale è la più tecnicamente difficile. Questo è il processo più laborioso. È necessario ridurre il tempo che l'assistente di laboratorio trascorre con il microscopio, limitandolo ai soli casi anormali.
I produttori di apparecchiature offrono sistemi di automazione ad alte prestazioni per grandi laboratori per aiutare a far fronte alla carenza di personale. In questo caso, l'assistente di laboratorio posiziona i campioni in una linea automatica. Il sistema invia quindi le provette all'analizzatore e in avanti per ulteriori test oa un "magazzino" a temperatura controllata dove i campioni possono essere prelevati rapidamente per ulteriori test. Anche l'applicazione automatizzata degli strisci e i moduli di colorazione riducono il tempo del personale. Ad esempio, l'analizzatore ematologico Mindray CAL 8000 utilizza il modulo di elaborazione del tampone SC-120, che può gestire 40 µl di campioni con un carico di 180 vetrini. Tutti i vetri vengono riscaldati prima e dopo la colorazione. Ciò ottimizza la qualità e riduce il rischio di infezione del personale.
Grado di automazione ini laboratori di ematologia aumenteranno e il personale diminuirà. C'è bisogno di sistemi complessi in cui si possano inserire campioni, cambiare lavoro e tornare solo per rivedere campioni veramente anomali.
La maggior parte dei sistemi di automazione sono personalizzabili in base alle esigenze di ciascun laboratorio, con configurazioni standardizzate disponibili in alcuni casi. Alcuni laboratori utilizzano il proprio software con il proprio sistema informativo e algoritmi di campionamento anomalo. Ma dovresti evitare l'automazione per il bene dell'automazione. I grandi investimenti nel progetto robotico di un moderno e costoso laboratorio automatico ad alta tecnologia sono vani per l'errore elementare di ripetere l'analisi del sangue di ogni campione con un risultato anomalo.
Conteggio automatizzato
La maggior parte degli analizzatori ematologici automatici misura o calcola i seguenti parametri: emoglobina, ematocrito, conta dei globuli rossi e volume medio, emoglobina media, concentrazione media di emoglobina cellulare, conta piastrinica e volume medio e conta leucocitaria.
L'emoglobina viene misurata direttamente da un campione di sangue intero utilizzando il metodo del cianometro dell'emoglobina.
Quando si esamina un analizzatore ematologico, il conteggio dei globuli rossi, dei globuli bianchi e delle piastrine può essere eseguito in diversi modi. Molti misuratori utilizzano il metodo dell'impedenza elettrica. Luisi basa sulla variazione della conduttività quando le cellule passano attraverso piccoli fori. Le dimensioni di questi ultimi differiscono per eritrociti, leucociti e piastrine. Il cambiamento di conducibilità si traduce in un impulso elettrico che può essere rilevato e registrato. Questo metodo consente anche di misurare il volume della cella. La determinazione della formula dei leucociti richiede la lisi degli eritrociti. Le diverse popolazioni di leucociti vengono quindi identificate mediante citometria a flusso.
L'analizzatore ematologico Mindray VS-6800, ad esempio, dopo l'esposizione ai reagenti, esamina i campioni in base alla diffusione della luce laser e ai dati di fluorescenza. Per identificare e differenziare meglio le popolazioni di cellule del sangue, in particolare per rilevare anomalie non rilevate con altri metodi, viene costruito un diagramma 3D. L'analizzatore ematologico BC-6800 fornisce dati su granulociti immaturi (inclusi promielociti, mielociti e metamielociti), popolazioni di cellule fluorescenti (come blasti e linfociti atipici), reticolociti immaturi ed eritrociti infetti oltre ai test standard.
Nell'analizzatore ematologico MEK-9100K di Nihon Kohden, le cellule del sangue sono perfettamente allineate da un flusso focalizzato idrodinamicamente prima di passare attraverso la porta di conteggio dell'impedenza ad alta precisione. Inoltre, questo metodo elimina completamente il rischio di ricontare le cellule, migliorando notevolmente l'accuratezza degli studi.
La tecnologia ottica laser Celltac G DynaScatter consente di ottenere una formula leucocitaria in uno stato quasi naturale. AL'analizzatore ematologico MEK-9100K utilizza un rilevatore di dispersione a 3 angoli. Da un angolo, puoi determinare il numero di leucociti, da un altro puoi ottenere informazioni sulla struttura della cellula e sulla complessità delle particelle di nucleocromatina e, dal lato, dati sulla granularità interna e sulla globularità. Le informazioni grafiche 3D sono calcolate dall'esclusivo algoritmo di Nihon Kohden.
Citometria a flusso
Effettuato per campioni di sangue, qualsiasi fluido biologico, aspirato di midollo osseo disperso, tessuto distrutto. La citometria a flusso è un metodo che caratterizza le cellule per dimensione, forma, composizione biochimica o antigenica.
Il principio di questo studio è il seguente. Le cellule si muovono a loro volta attraverso la cuvetta, dove sono esposte a un fascio di luce intensa. Le cellule del sangue diffondono la luce in tutte le direzioni. La dispersione in avanti risultante dalla diffrazione è correlata al volume cellulare. La dispersione laterale (ad angolo retto) è il risultato della rifrazione e ne caratterizza approssimativamente la granularità interna. I dati forward e side scatter possono identificare, ad esempio, popolazioni di neutrofili e linfociti che differiscono per dimensioni e granularità.
La fluorescenza viene anche utilizzata per rilevare diverse popolazioni nella citometria a flusso. Gli anticorpi monoclonali utilizzati per identificare gli antigeni citoplasmatici e di superficie cellulare sono spesso etichettati con composti fluorescenti. Ad esempio, la fluoresceinao R-ficoeritrina hanno spettri di emissione diversi, consentendo di identificare gli elementi formati dal colore del bagliore. La sospensione cellulare viene incubata con due anticorpi monoclonali, ciascuno marcato con un diverso fluorocromo. Quando le cellule del sangue con anticorpi legati passano attraverso la cuvetta, il laser a 488 nm eccita i composti fluorescenti, facendoli brillare a lunghezze d'onda specifiche. Il sistema di lenti e filtri rileva la luce e la converte in un segnale elettrico che può essere analizzato da un computer. Diversi elementi del sangue sono caratterizzati da una diversa dispersione laterale e in avanti e dall'intensità della luce emessa a determinate lunghezze d'onda. I dati composti da migliaia di eventi vengono raccolti, analizzati e riassunti in un istogramma. La citometria a flusso viene utilizzata nella diagnosi di leucemie e linfomi. L'uso di vari marcatori di anticorpi consente un'identificazione cellulare precisa.
L'analizzatore ematologico Sysmex utilizza sodio lauril solfato per testare l'emoglobina. È un metodo senza cianuro con un tempo di reazione molto breve. L'emoglobina è determinata in un canale separato, che riduce al minimo l'interferenza da alte concentrazioni di leucociti.
Reagenti
Quando si sceglie uno strumento per analisi del sangue, considerare quanti reagenti sono necessari per un analizzatore ematologico, nonché i relativi costi e requisiti di sicurezza. Si possono acquistare da qualsiasi fornitore o solo dal produttore? Ad esempio Erba ELite 3 misura 20 parametri con solo tre ecologici e gratuitireagenti al cianuro. I modelli Beckman Coulter DxH 800 e DxH 600 utilizzano solo 5 reagenti per tutte le applicazioni, inclusi gli eritrociti nucleati e la conta dei reticolociti. ABX Pentra 60 è un analizzatore ematologico con 4 reagenti e 1 diluente.
Anche la frequenza di sostituzione dei reagenti è importante. Ad esempio, Siemens ADVIA 120 dispone di una scorta di prodotti chimici analitici e di lavaggio per 1.850 test.
Ottimizzazione automatizzata dell'analizzatore
Secondo gli esperti, si presta troppa attenzione al miglioramento degli strumenti di laboratorio e non abbastanza per ottimizzare l'uso delle tecnologie automatizzate e manuali. Parte del problema è che i laboratori di ematologia sono formati in patologia anatomica piuttosto che in medicina di laboratorio.
Molti specialisti svolgono le funzioni di verifica, non di interpretazione. Il laboratorio dovrebbe avere 2 funzioni: essere responsabile dei risultati dell'analisi e interpretarli. Il prossimo passo sarà la pratica della medicina basata sull'evidenza. Se, dopo aver eseguito 10.000 test, non ci sono prove che non possano essere verificati automaticamente con esattamente gli stessi risultati, allora questo non dovrebbe essere fatto. Allo stesso tempo, se 10.000 analisi hanno fornito nuove informazioni mediche, dovrebbero essere riviste alla luce delle nuove conoscenze. Finora, la pratica basata sull'evidenza è al livello iniziale.
Formazione del personale
Un altro problema è aiutare gli assistenti di laboratorio non solo a studiare le istruzioni per l'analizzatore ematologico, mama anche per comprendere le informazioni ricevute con il suo aiuto. La maggior parte degli specialisti non ha tale conoscenza della tecnologia. Inoltre, la comprensione della rappresentazione grafica dei dati è limitata. La sua correlazione con i risultati morfologici deve essere enfatizzata in modo da poter estrarre più informazioni. Anche un esame emocromocitometrico completo diventa troppo complesso, generando un'enorme quantità di dati. Tutte queste informazioni devono essere integrate. I vantaggi di più dati devono essere soppesati rispetto alla maggiore complessità che comporta. Ciò non significa che i laboratori non debbano accettare i progressi dell' alta tecnologia. È necessario combinarli con il miglioramento della pratica medica.
